治疗活性的α-MSH类似物的制作方法

来自 : www.xjishu.com/zhuanli/26/2013 发布时间：2021-03-25

治疗活性的α-MSH类似物的制作方法
【专利摘要】本发明涉及治疗活性的α-MSH类似物。本发明描述了α-促黑素细胞激素（α-MSH）的肽类似物，所述肽类似物与天然α-MSH肽相比具有提高的功效。与α-MSH相比，α-MSH类似物表现出提高的抗炎效果以及提高的防止局部缺血情况的能力。本发明进一步公开了该肽用于制备药物组合物的用途，和药物组合物，所述药物组合物用于治疗或预防哺乳动物的一个或多个器官的组织的病况。
【专利说明】治疗活性的a -MSH类似物
[0001]本申请是原申请的申请日为2005年8月26日，申请号为200580051680.9，发明名称为“治疗活性的a -MSH类似物”的中国专利申请的分案申请。
【技术领域】
[0002]本发明涉及a-促黑素细胞激素(a-MSH)的肽类似物，所述肽类似物与天然a-MSH肽相比具有提高的功效。与a-MSH相比，a-MSH类似物表现出提高的抗炎效果以及提高的治疗或预防与局部缺血或后面是血管再灌注的局部缺血相关的全身损伤、器官损伤或细胞损伤的能力。
【背景技术】
[0003]天然肽a -促黑素细胞激素(a -MSH)作为I型、3型、4型和5型黑皮质素(MC)受体的天然激动剂已经为人们熟知。MC受体属于G-蛋白偶联受体的类型。所有的受体亚型都被偶联到激活型G-刺激蛋白(G-stimulatory protein),这意味着受体激活涉及到提高的cAMP含量。ACTH是2型受体(MC2)的天然配基。
[0004]在许多组织中关于MC受体已经进行了大量的研究。已经知道，a -MSH以极大的亲和力结合到其上的I型受体(MCl)在一些组织和细胞例如脑中表达，包括星形细胞、睾丸、卵巢、巨噬细胞和嗜中性粒细胞。然而，MCl可能能在更宽范围的组织中表达，尽管这还需要去建立。MC受体结合不同MSH肽的选择性是变化的。MCl以极大的亲和力结合a-MSH，也以较低的亲和力结合运-MSH、y-MSI^PACTH。据报导，MC2仅结合ACTH，而不结合任何一种MSH肽。对其他受体的配基的最高亲和力包括Y-MSH (MC3-受体)和P-MSH (MC4-受体)。相反，MC5以与MCl相同的方式以非常低的亲和力结合MSH肽(即对a-MSH最高的亲和力)。
[0005]通过激活MC-受体起作用的MSH-`肽具有各种功能，包括免疫、抗炎、体温调节、痛感、醛固酮合成、血压调节、心率、血管紧张度、脑血流量、神经生长、胎盘发育、许多激素(例如醛固酮、甲状腺素、催乳激素、FSH)的合成/释放。ACTH在激活类固酮生成(steroidoneogenesis)上具有主要作用。a -MSH也诱导皮肤色素形成。
[0006]需要重点强调的是，MSH肽，特别是a -MSH的关于哪些受体被涉及的许多作用还没有完全建立起来。据推测a-MSH的抗炎作用涉及各种过程包括干扰NO生产、内皮素-1作用、白介素10形成，这又关联到巨噬细胞和单核细胞中表达的MCl受体。
[0007]已经证实MC受体对a-MSH的激活作用在各种炎症过程中是重要的(Lipton和Catanial997):1)抑制嗜中性粒细胞的趋药性迁移(Cataniaigge)J) a-MSH包括其类似物抑制对LPS处理响应的细胞因子(IL-1，TNF-a )的释放(Goninardl996)。3)抑制对细菌内毒素响应的1,-0(数)叩，1(.￥.等，1997)。4)ICV或IP给药a-MSH抑制通过局部给予LPS而引起的中枢系统的TNF-a生产。5)已经证实0-|^11减轻实验性炎症性肠病(1^]_0^，N.等，1997)和局部缺血诱导的急性肾衰竭(Star，R.A.等，1995)的炎症。6)通过抑制接触性过敏的诱导和激发，a -MSH还具有一定的预防效果以及诱导半抗原耐受性，并且人们推测a-MSH可能介导皮肤炎症和高增生皮肤病的重要的负调节(Luger，T.A.，1997)。最后，a -MSH导致来自皮肤微维管结构的内皮细胞的提高的IL-8释放(Hartmeyer，M.，1997)。
[0008]低氧症(局部缺血)和再灌注损伤两者在人病理生理学中都是重要的因素。组织低氧症的实例(在再灌注过程中预先处理为损伤)包括循环系统休克、心肌局部缺血、中风、一过性肾局部缺血、大外科手术和器官移植。因为归因于局部缺血的疾病是极其常见的发病率和死亡率原因，并且因为器官移植越来越频繁，为了改善公众的健康水平，非常需要具有限制再灌注损伤能力的治疗策略。局部缺血再灌注损伤的基础病理生理学是复杂的，不仅涉及到对嗜中性粒细胞-浸润的典型的炎症再灌注反应，而且涉及到再灌注组织/器官内细胞因子的基因表达，所述细胞因子包括肿瘤坏死因子-a (TNF-a )、白介素(IL)_1 3、IL-6、IL_8、干扰素-Y和胞间粘附分子-1 (ICAM-1)。此外，人们认为，通过直接抑制收缩性和诱导细胞凋亡，局部产生的TNF-a促成如在梗死后心脏中引起局部缺血后器官机能障碍。由于局部缺血和/或再灌注复杂的性质，已经证实简单的抗炎治疗概念是无效的:因此，大多数实验研究指向这样的事实，即为了保护避免再灌注损伤，需要有与一个以上激活通路的伴行的相互作用。已经证实，a-MSH同时具有抗炎的、抗氧化的和抗细胞凋亡的能力，这对于该化合物为了保护避免再灌注损伤的效力给出了很好的解释。
[0009]已知a-MSH氨基酸序列的氨基酸残基的特定修饰可导致肽提高的受体亲和力(对例如MC4受体)、延长的生物活性或更多的受体特异性结合分布型(receptor-specificbinding profile) (Schiotil 等，1997 ；Hruby 等，1995 ；Sawyer 等，1980 ；Hiltz 等 1991 ；Scardenings等,2000)。然而，当旨在生产肽药物时,这些肽还具有对酶降解低稳定性的问题。
[0010]如上所述，开发肽治疗活性的药物的问题是肽快速并且非常高效地被酶降解，通常具有在几分钟范围内的半衰期。蛋白酶和其他蛋白水解酶是无所不在的，特别是在胃肠道中更是如此，因此在口服时肽常常在多个位点对降解敏感，并且在血、肝、肾和血管内皮中在某种程度上也对降解敏感。此外，特定肽常常在主链内的一个以上键上对降解敏感；每一个水解位置由特定蛋白酶介导。即使克服了这些障碍，特别是对于神经肽，已经遇到了在它们跨越血-脑屏障运输方面的困 难。
[0011]为了提高肽的代谢稳定性，Larsen等1999 (W099/46283)已经开发出了一种被称为SIP (结构诱导探针)的技术。SIP技术基于结构诱导探针的使用，该结构诱导探针以短肽序列为代表，即附加到亲本肽的C-端或N-端或者同时附加到C-端和N-端的(Lys)6。基于分子内的氢键，结构诱导探针强迫亲本肽成为更有序的构象，借此，与处于无规卷曲构象的肽相反，肽嵌合体(连接到探针的肽)对蛋白酶敏感度低。作为结构化的结果，肽嵌合体更难于被蛋白酶降解。附加SIP到生物活性肽常常导致肽的酶稳定性的提高而同时生物活性保持不变(Rizzi等2002)。
[0012]发明概述
[0013]令人意外的是，本发明已经证实，与天然a -MSH肽相比，a -MSH和a -MSH类似物在肽的N-端的SIP-修饰提高了肽的最大功效。与天然a-MSH肽相比，本发明的肽显示出了提闻的抗炎效果和提闻的预防局部缺血症状的能力。
[0014]因此，本发明涉及特定的肽，所述肽包括在肽的N-端部分的SIP修饰和在肽的C-端部分的a -MSH或a -MSH变体的氨基酸序列。[0015]第一方面，本发明提供了总计为12~19个氨基酸残基的肽，所述肽包括如下氨基酸序列:
[0016]X-Aaj-Aag-Aag-Aa4^ag-Y-Aag-Aay-Z
[0017]其中X包括6个氨基酸残基R1-R2-R3-R4-R5-R6，其中Rl、R2、R3、R4、R5和R6可以独立地是Lys或Glu,和
[0018]其中Y 包括选自 His-Phe-Arg、His- (D-Phe) -Arg His-Nal-Arg 和His- (D-Nal)-Arg的氨基酸序列,和
[0019]其中Z包括选自Lys-Pro-Val和Lys-Pro-(D-Val)的氨基酸序列，和
[0020]其中AapAa2JayAapAapAa6和Aa7可以独立地是任何一种天然存在的或非天然存在的氨基酸残基或者缺失，和
[0021]其中所述肽的羧基端是-C(=0)-BI，其中BI选自0H、NH2、NHB2、N(B2) (B3)、0B2和B2，其中B2和B3独立地选自可以被取代的CV6烷基、可以被取代的C2_6链烯基、可以被取代的C6-Ki芳基、可以被取代的C7_16芳烷基和可以被取代的C7_16烷基芳基；和
[0022]其中所述肽的氨基端是(B4) HN-、(B4) (B5) N-或(B6) HN-，其中B4和B5独立地选自H、可以被取代的CV6烷基、可以被取代的C2_6链烯基、可以被取代的C6,芳基、可以被取代的C7_16芳烷基和可以被取代的C7_16烷基芳基；B6是B4-C(=0)-。
[0023]本发明还涉及所述肽用于制备用于治疗或预防哺乳动物的一个或多个器官的组织的病况的药物组合物的用 途。此外，本发明涉及组合物例如药物组合物，根据本发明的肽在医学上的用途以及用于治疗哺乳动物的一个或多个器官的组织的病况的方法，其中所述药物组合物包括一种或多种根据本发明的肽和药学上可接受的载体，所述方法包括给予有效剂量的根据本发明的肽。具体地，本发明关注于用于治疗由局部缺血、炎症和/或中毒或者药物治疗的毒性效应引起的病况的方法。

【发明内容】

[0024]本发明涉及治疗活性的肽，所述肽具有减轻或防止由局部缺血、炎症和/或毒中毒或者药物治疗的毒性效应引起的器官机能障碍的效果。
[0025]如本文所定义的，如果它能够用于治疗、缓解或减弱疾病状态、生理病况、症状或病原学指示或评价或其诊断，那么肽序列是“治疗活性的”。如果它能够用于防止疾病状态、生理病况、症状或病原学指示，那么肽序列是“预防活性的”。药理学活性的制剂也是生理和/或生物活性的。药理学活性测量在离体、体内或体外的生理系统或生物系统中物质(肽)的效果，并且可以使用本领域熟知的、用于特定肽或者具有相似生理功能的肽的、标准的离体、体内或体外分析法进行分析。
[0026]本发明的肽
[0027]本发明涉及一种肽，所述肽包括包括在肽的C-端部分的a-MSH或a_MSH变体的氨基酸序列和在肽的N-端部分的结构诱导探针(SIP)。本发明的肽被称为a-MSH类似物。在本说明书和权利要求中，这些术语被同义使用。
[0028]a-MSH变体被定义为一种氨基酸序列，所述氨基酸序列与天然a-MSH (Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val, SEQ ID NO:101)相比，被修饰为在序列中具有至少一个氨基酸残基缺失、取代、叠加或修饰。a-MSH变体优选具有如下结构=Aa1-Aa2-Aa3-Aa4-Aa5-Y-Aa6-Aa7-Z,其中 Y 包括选自 His-Phe-Arg、His-(D-Phe)-Arg、His-Nal-Arg和His-(D-Nal)-Arg的氨基酸序列，和其中Z包括选自Lys-Pro-Val和Lys-Pro-(D-Val),和其中AapAayAayAapAapAa6和Aa7可以独立地是任何一种天然存在的或非天然存在的氨基酸残基或者缺失。
[0029]在本文中，术语“氨基酸残基”是指任何一种天然存在的氨基酸残基(天然的氨基酸残基)或者非天然存在的氨基酸残基(非天然的氨基酸残基)。
[0030]天然的氨基酸残基被定义为在自然界出现的氨基酸残基，例如Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Gin、Glu、Gly、His、lie、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Tyr、Thr、Trp、Val。
[0031]至于a-MSH变体结构，优选的天然的氨基酸残基的实例是Ser、Tyr、Met、Glu、lie、Trp 和 Gly0
[0032]非天然的氨基酸残基被定义为不在自然界出现的而是实验创造的氨基酸残基。非天然的氨基酸残基包括合成的a、0或Y-氨基酸残基(不管L-构型还是D-构型)以及侧链修饰的氨基酸，例如修饰的酪氨酸，其中芳环还取代有例如一个或多个卤素、磺酸基、硝基等，和/或苯酚基被转变为酯基等，所述非天然的氨基酸残基包括侧链保护的氨基酸，其中根据肽化学领域的普通技术人员熟知的方法对氨基酸侧链进行保护，例如记载于例如Bodanszky等1994与J.Jones和Jonesl991的方法。优选的非天然的氨基酸残基的实例是正亮氨酸(Nle)、Nal ( P _2_萘基-丙氨酸)、D_Nal ( P _2_萘基-D-丙氨酸)，D-苯丙氨酸(D-Phe )和 D-缬氨酸(D-Val)。
[0033]在最宽的方面，本发明涉及总计为12~19个氨基酸残基的肽，所述肽包括如下氨基酸序列:
[0034]X~Aa1~Aa2~Aa^~Aai~Aa5~Y~Aa6~Aa7~Z`[0035]其中X包括6个氨基酸残基R1-R2-R3-R4-R5-R6，其中Rl、R2、R3、R4、R5和R6可以独立地是Lys或Glu,和
[0036]其中Y 包括选自 His-Phe-Arg、His-(D-Phe)-Arg、His-Nal-Arg 和His-(D-Nal)-Arg的氨基酸序列,和
[0037]其中Z包括选自Lys-Pro-Val和Lys-Pro-(D-Val)的氨基酸序列，和
[0038]其中AapAa2JayAapAapAa6和Aa7可以独立地是任何一种天然存在的或非天然存在的氨基酸残基或者缺失，和
[0039]其中所述肽的羧基端是-C(=0)-BI，其中BI选自0H、NH2、NHB2、N(B2) (B3)、0B2和B2，其中B2和B3独立地选自可以被取代的CV6烷基、可以被取代的C2_6链烯基、可以被取代的C6-Ki芳基、可以被取代的C7_16芳烷基和可以被取代的C7_16烷基芳基；和
[0040]其中所述肽的氨基端是(B4) HN-、(B4) (B5) N-或(B6) HN-，其中B4和B5独立地选自H、可以被取代的CV6烷基、可以被取代的C2_6链烯基、可以被取代的C6,芳基、可以被取代的C7_16芳烷基和可以被取代的C7_16烷基芳基；B6是B4-C(=0)-。
[0041]在本发明的上下文中，术语“可以被取代的”是用来指所述的基团可以被一个或多个选自Ci_8烷基、Ci_8烷氧基、氧代(可以表示为异构的烯醇式)、羧基、氨基、羟基(当存在于烯醇系统时可表示为异构的酮式)、硝基、氰基、二卤代-Cm烷基、三卤代-Cu烷基、卤素的基团取代一次或几次，例如I~5次，优选I~3次，更优选I~2次。通常，上述取代可进行另外的任选取代。[0042]在本文中，术语“(^_6烷基”是用来指直链的或支链的饱和烃链，其中最长的链具有I~6个碳原子，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、己基、庚基和辛基。支链烃链是用来指在任何一个碳原子被烃链取代的C^6烷基。
[0043]在本文中，术语“C2_6链烯基”是用来指有2~6个碳原子并且含有一个或多个双键的直链或支链经基。C2_6链烯基的不例性实例包括稀丙基、闻稀丙基、乙烯基、巴基、丁烯基、戍烯基和己烯基。具有一个以上双键的C2_6链烯基的不例性实例包括丁二烯基、戍二烯基、己二烯基和己三烯基以及它们的支化形式。不饱和键(双键)的位置可以是在碳链的任何一个位置。
[0044]在本文中术语“C3_8-环烷基”是用来覆盖只含碳原子的三、四、五、六、七和八元环，而术语“杂环”是用来指碳原子与I~3个杂原子一起构成的三、四、五、六、七和八元环。杂原子独立地选自氧、硫和氮。
[0045]C3_8_环烷基和杂环可以任选地含有一个或多个不饱和键，但是所述不饱和键处于不形成芳族电子体系的情形。
[0046]优选的“C3_8-环烷基”的示例性实例是环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊二烯、环己烷、环己烯、1，3-环己二烯，1，4-环己二烯、环庚烷、环庚烯、1，2-环庚二烯、1，3-环庚二烯、I, 4-环庚二烯和1，3, 5-环庚三烯。
[0047]“杂环”的示例性实例是2H-噻喃、3H-噻喃、4H-噻喃、四氢噻喃、2H-吡喃、四氢吡喃、哌唳、1，2-二硫杂环己 烯、1，2-二硫杂环己烧、1，3-二硫杂环己烯、1，3-二硫杂环己烧、I, 4- 二硫杂环己烯、1，4- 二硫杂环己烷、I, 2- 二氧杂环己烯，I, 2- 二氧杂环己烷、1，3- 二氧杂环己烯、1，3-二氧杂环己 烷、1，4-二氧杂环己烯、1，4-二氧杂环己烷、哌嗪、1，2-氧硫杂环己烯、1，2-氧硫杂环己烧、4H-1, 3-氧硫杂环己烯、1，3-氧硫杂环己烧、1，4-氧硫杂环己烯、1，4-氧硫杂环己烷、2H-1，2-噻嗪、四氢-1，2-噻嗪、2H-1，3-噻嗪、4H-1，3-噻嗪、5，6- 二氢-4H-噻嗪、4H-1，4-噻嗪、四氢-1, 4-噻嗪、2H-1，2-鳴嗪、4H-1，2-喝.嗪、6H-1, 2-爆.嗪、2H-1，3-嚷嗪、4H-1，3-嚷嗪、4H-1，4-噃嗪、马来酰亚胺、琥珀酰亚胺、咪
唑、吡唑、吡咯、爆唑、呋咱、巴比妥酸、硫代巴比妥酸、二氧代哌嗪、异嗔唑、乙内酰脲、二氢尿嘧啶、吗啉、三氧杂环己烷、4H-1，2，3-三硫杂环己烯、1，2，3-三硫杂环己烷、1，3，5-三硫杂环己烷、六氢-1，3，5-三嗪、四氢噻吩、四氢呋喃、吡咯啉、吡咯烷、吡咯烷酮、吡咯烷二酮、吡唑啉、吡唑烷、咪唑啉、咪唑烷、1，2-二氧杂环戊烯、1，2-二氧杂环戊烷、1，3-二氧杂环戊烯、1，3- 二氧杂环戊烷、3H-1，2- 二硫杂环戊烯、1，2- 二硫杂环戊烷、1，3- 二硫杂环戊烯、I，3- 二硫杂环戊烷、异嗓唑啉、异嗔,唑烷、略唑啉、鳴.唑烷、噻唑啉、噻唑烷、3H-1, 2-氧硫杂环戍烯、1，2-氧硫杂环戍烧、5H-1, 2-氧硫杂环戍烯、1，3-氧硫杂环戍烯、I, 3-氧硫杂环戊烷、1,2, 3-三硫杂环戊烯、1，2，3-三硫杂环戊烷、1,2,4-三硫杂环戊烷、1,2, 3-三氧杂环戊烯、1，2，3-三氧杂环戊烷、1，2，4-三氧杂环戊烷、1，2，3-三唑啉和1，2，3-三唑烷。对杂环的结合可以是在杂原子的位置或者通过杂环的碳原子。
[0048]在本文中术语“芳基”是用来指芳香碳环或环体系。此外，术语“芳基”包括稠环体系其中至少两个芳环，或者至少一个芳基和至少一个C3_8_环烷基，或者至少一个芳基和至少一个杂环共用至少一个化学键。“芳基”环的示例性实例包括可以被取代的苯基、萘基、菲基、蒽基、苊基、1，2，3，4-四氢化萘基、芴基、茚基、吲哚基、苯并二氢呋喃基、香豆素基、苯并二氢批喃基、异苯并二氢批喃基.蕊和基(azulenyl)。优选的芳基是苯基。
[0049]在本文中术语“C7_16芳烷基”是用来指以CV6烷基取代的C6,芳基。
[0050]在本文中术语“C7_16烷基芳基”是用来指以C6,芳基取代的Cu烷基。
[0051] 在一个实施方式中，本发明涉及总计为12~19个氨基酸残基的肽，所述肽包括选自由以下物质所组成的组中的氨基酸序列:
[0052]X-Y-Z，
[0053]X-Aa1-Y-Z?
[0054]X_Aa「Aa2_Y_Z，
[0055]X_Aa「Aa2_Aa3_Y_Z，
[0056]X-Aa1-Aa2-Aa3-Aa4U,
[0057]X-Aa1-Aa2-Aa3-Aa4-Aa5-Y-Z,
[0058]X_Aa「Y_Aa6_Z，
[0059]X_Aa「Aa2_Y_Aa6_Z，
[0060]X-Aa1-Aa2-Aa3-Y-Aa6-Z,
[0061 ]X-Aa1-Aa2-Aa3-Aa4-Y-Aa6-Z,
[0062]X-Aa1-Aa2-Aa3-Aa4-Aa5-Y-Aa6-Z，
[0063]X_Aa「Y_Aa6_Aa7_Z，
[0064]X_Aa「Aa2_Y_Aa6_Aa7_Z，
[0065]X-Aa1-Aa2-Aa3-Y-Aa6-Aa7-Z，
[0066]X-Aa1-Aa2-Aa3-Aa4-Y-Aa6-Aa7-Z,和
[0067]X_Aa1_Aa2_Aa3_Aa4_Aa5_Y_Aa6_Aa7_Z。
[0068]其中X包括6个氨基酸残基R1-R2-R3-R4-R5-R6，其中Rl、R2、R3、R4、R5和R6可以独立地是Lys或Glu，和
[0069]其中Y 包括选自 His-Phe-Arg、His-(D-Phe)-Arg、His-Nal-Arg 和His-(D-Nal)-Arg的氨基酸序列，和
[0070]其中Z包括选自Lys-Pro-Val和Lys-Pro-(D-Val)的氨基酸序列，和
[0071]其中Aa1、Aa2、Aa3、Aa4、Aa5、Aa6和Aa7可以独立地是任何一种天然的或者非天然的氣基酸残基或者缺失，和
[0072]其中所述肽的羧基端是-C(=0)-BI，其中BI选自0H、NH2、NHB2、N(B2) (B3)、0B2和B2，其中B2和B3独立地选自可以被取代的Cp6烷基、可以被取代的C2_6链烯基、可以被取代的C6—1C)芳基、可以被取代的C7—16芳烷基和可以被取代的C7—16烷基芳基；和
[0073]其中所述肽的氨基端是(B4)HN-、(B4) (B5)N_或(B6)HN_，其中B4和B5独立地选自H、可以被取代的Cp6烷基、可以被取代的C2—6链烯基、可以被取代的C6,芳基、可以被取代的C7_16芳烷基和可以被取代的C7_16烷基芳基；B6是B4-C(=0)-。
[0074]在优选的实施方式中，本发明涉及一种肽，其中肽包括下述氨基酸序列:
[0075]X_Aa1_Aa2_Aa3_Aa4_Aa5_Y_Aa6_Aa7_Z。
[0076]其中Aa1\' Aa2.Aa3、Aa4.Aa5\' Aa6和Aa7可以独立地是任何一种天然或非天然氨基酸。因而，Aa1\'Aa2、Aa3、Aa4、Aa5、Aa6和Aa7均存在于本发明的肽中。[0077]在一个实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽，其中氨基端是(B4)HN_，其中B4=H。
[0078]在另ー实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽，其中所述肽的羧基端是-C(=0)-B1，其中 BI = OH0
[0079]有几种方法能够用来稳定肽使其抗降解以及降低肽与其他化合物、试剂和/或肽/蛋白质(例如在血浆中)进行反应的能力。本发明还涉及根据本发明被那些本领域熟知的方法修饰的肽。在优选的实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽，其中肽的氨基端被乙酰化修饰。因此，在优选的实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽，其中氨基端是(B6)HN-，其中B6 = B4-C(=0)-，和B4 = CH3。在另ー优选的实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽，其中肽的羧基端被酰胺化修饰。因此，本发明涉及根据本发明的肽，其中所述肽的羧基端是-C(=0)-B1，其中 BI = NH20
[0080]在本发明最宽的方面，X选自Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (序列表序列37 (SEQ IDNo:37))、Glu-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys (序列表序列 38)、Lys-Glu-Lys-Lys-Lys-Lys (序列表序列 39)、Lys-Lys-Glu-Lys-Lys-Lys (序列表序列 40)、Lys-Lys-Lys-Glu-Lys-Lys (序列表序列 41)、Lys-Lys-Lys-Lys-Glu-Lys (序列表序列 42)、Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Glu(序列表序列 43)、Glu-Glu-Lys-Lys-Lys_Lys (序列表序列 44)、Glu-Lys-Glu-Lys-Lys_Lys(序列表序列 45) ^Glu-Lys-Lys-Glu-Lys-Lys (序列表序列 46) ^Glu-Lys-Lys-Lys-Glu-Lys(序列表序列 47)^Glu-Lys-Lys-Lys-Lys-Glu (序列表序列 48)^Lys-Glu-Glu-Lys-Lys-Lys(序列表序列 49)、Lys-Glu-Lys-Glu-Lys_Lys (序列表序列 50)、Lys-Glu-Lys-Lys-Glu_Lys(序列表序列 51)、Lys-Glu-Lys-Lys-Lys_Glu (序列表序列 52)、Lys-Lys-Glu-Glu-Lys_Lys(序列表序列 53)、Lys-Lys-Glu-Lys-Glu_Lys (序列表序列 54)、Lys-Lys-Glu-Lys-Lys_Glu(序列表序列 55)、Lys-Lys-Lys-Glu-Glu_Lys (序列表序列 56)、Lys-Lys-Lys-Glu-Lys_Glu(序列表序列 57)、Lys-Lys-Lys-Lys-Glu_Glu (序列表序列 58)、Glu-Glu-Glu-Lys-Lys_Lys(序列表序列 59) ^Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Lys (序列表序列 60) ^Glu-Glu-Lys-Lys-Glu-Lys(序列表序列 61)、Glu-Glu-Lys- Lys-Lys_Glu (序列表序列 62) ^Glu-Lys-Glu-Glu-Lys-Lys(序列表序列 63) ^Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Lys (序列表序列 64) ^Glu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu(序列表序列 65) ^Glu-Lys-Lys-Glu-Glu-Lys (序列表序列 66) ^Glu-Lys-Lys-Glu-Lys-Glu(序列表序列 67)、Glu-Lys-Lys-Lys-Glu_Glu (序列表序列 68)^Lys-Lys-Lys-Glu-Glu-Glu(序列表序列 69)、Lys-Lys-Glu-Lys-Glu_Glu (序列表序列 70)、Lys-Lys-Glu-Glu-Lys_Glu(序列表序列 71)、Lys-Lys-Glu-Glu-Glu_Lys (序列表序列 72)、Lys-Glu-Lys-Lys-Glu_Glu(序列表序列 73)、Lys-Glu-Lys-Glu-Lys_Glu (序列表序列 74)、Lys-Glu-Lys-Glu-Glu_Lys(序列表序列 75)、Lys-Glu-Glu-Lys-Lys_Glu (序列表序列 76)、Lys-Glu-Glu-Lys-Glu_Lys(序列表序列 77)、Lys-Glu-Glu-Glu-Lys_Lys (序列表序列 78)、Lys-Lys-Glu-Glu-Glu_Glu(序列表序列 79)、Lys-Glu-Lys-Glu-Glu_Glu (序列表序列 80)、Lys-Glu-Glu-Lys-Glu_Glu(序列表序列 81)、Lys-Glu-Glu-Glu-Lys_Glu (序列表序列 82)、Lys-Glu-Glu-Glu-Glu_Lys(序列表序列 83) ^Glu-Lys-Lys-Glu-Glu-Glu (序列表序列 84) ^Glu-Lys-Glu-Lys-Glu-Glu(序列表序列 85) ^Glu-Lys-Glu-Glu-Lys-Glu (序列表序列 86) ^Glu-Lys-Glu-Glu-Glu-Lys(序列表序列 87)、Glu-Glu-Lys-Lys-Glu_Glu (序列表序列 88)^Glu-Glu-Lys-Glu-Lys-Glu(序列表序列 89) ^Glu-Glu-Lys-Glu-Glu-Lys (序列表序列 90) ^Glu-Glu-Glu-Lys-Lys-Glu(序列表序列 91)、Glu-Glu-Glu-Lys-Glu_Lys (序列表序列 92)、Glu-Glu-Glu-Glu-Lys_Lys(序列表序列 93)、Lys-Glu-Glu-Glu-Glu_Glu (序列表序列 94)、Lys-Glu-Glu-Glu-Glu_Glu(序列表序列 94)、Glu-Lys-Glu-Glu-Glu_Glu (序列表序列 95)、Glu-Glu-Lys-Glu-Glu_Glu(序列表序列 96)^Glu-Glu-Glu-Lys-Glu-Glu (序列表序列 97)、Glu-Glu-Glu-Glu-Lys_Glu(序列表序列 98)、Glu_Glu_Glu_Glu_Glu_Lys (序列表序列 99)、Glu_Glu_Glu_Glu_Glu_Glu(序列表序列100)。
[0081]目前本发明优选的肽是如下肽序列的稳定化合物:
[0082]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列I)
[0083]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列2)
[0084]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列3)
[0085]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列4)
[0086]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Ar g-Trp-GIy-Lys-Pro-Val (序列表序列5)
[0087]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列6)
[0088]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 7)
[0089]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 8)
[0090]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列9)
[0091]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列10)
[0092]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 11)
[0093]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 12)
[0094]Lys—Lys—Lys—Lys—Lys—Lys—Ser—ber—Iie—Ile—ber—his—Pne—Arg—Trp—Giy—Lys—Pro-Val (序列表序列13)
[0095]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列14)
[0096]Lys—Lys—Lys—Lys—Lys—Lys—Ser—ber—Iie—Ile—ber—his—Pne—Arg—Trp—Giy—Lys—Pro-(D-Val)(序列表序列15)
[0097]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列16)[0098]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列17)
[0099]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列18)
[0100]Lys_Lys_Lys_Lys_Lys_Lys_Ser_ber_I _Le_Ile_ber_his_ (D-Phe) -Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 19)
[0101]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 20)
[0102]Lys_Lys_Lys_Lys_Lys_Lys_Ser_ber_Ij_e_Ile_ber_his_D_Nal—Arg—Trp—biy—Lys-Pro-Val (序列表序列21)
[0103]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列22)
[0104]Lys_Lys_Lys_Lys_Lys_Lys_Ser_ber_Ij_e_Ile_ber_his_D_Nal—Arg—Trp—biy—Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 23)
[0105]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列 24)
[0106]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列25) [0107]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列26)
[0108]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro- (D-Val)(序列表序列27)
[0109]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro- (D-Val)(序列表序列28)
[0110]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Nle-Glu-His-(D-Phe)_Arg_Trp_Gly_Lys_Pro_Va丄(序列表序列29)
[0111]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val(序列表序列30)
[0112]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-VaI)(序列表序列31)
[0113]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-VaI)(序列表序列32)
[0114]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列33)
[0115]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列34)
[0116]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro- (D-Val)(序列表序列35)和
[0117]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro- (D-Val)(序列表序列36)
[0118]可以通过修饰上述肽的N-端和/或C-端进行稳定化，例如こ酰化本发明肽的N-端和/或酰胺化本发明肽的C-端。
[0119]对于天然氨基酸，用熟知的三字母密码给出氨基酸序列。天然氨基酸残基的修饰和取代缩写如下:Nle是用于正売氨酸的缩写。D-Nal是用于P-2-萘基-d_丙氨酸的缩写。D-Val (D-缬氨酸)是用于D-构型缬氨酸的缩写。D-Phe (D-苯丙氨酸)是用于D-构型苯丙氨酸的縮写。
[0120]在优选的实施方式中，本发明涉及ー种肽，所述肽是如下氨基酸序列的N-端被こ酰化并且C-端被酰胺化的化合物:
[0121]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列I)。
[0122]在另ー优选的实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽，所述肽是如下氨基酸序列的N-端被こ酰化并且C-端被酰胺化的化合物:
[0123]Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列2)。
[0124]在另ー优选的实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽，所述肽是以下氨基酸序列的N-端こ酰化并且C-端酰胺化的化合物:
[0125]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)(序列表序列3)。`
[0126]在另ー优选的实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽，所述肽是如下氨基酸序列的N-端被こ酰化并且C-端被酰胺化的化合物:
[0127]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列5)。
[0128]在另ー优选的实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽，所述肽是如下氨基酸序列的N-端被こ酰化并且C-端被酰胺化的化合物:
[0129]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His- (D-Nal )_Arg_Trp_Gly_Lys-Pro-Val (序列表序列9)。
[0130]在另ー优选的实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽，所述肽是如下氨基酸序列的N-端被こ酰化并且C-端被酰胺化的化合物:
[0131]Lys—Lys—Lys—Lys—Lys—Lys—Ser—ber—Iie—Ile—ber—his—Pne—Arg—Trp—Giy—Lys—Pro-Val (序列表序列13)。
[0132]在另ー优选的实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽，所述肽是如下氨基酸序列的N-端被こ酰化并且C-端被酰胺化的化合物:
[0133]Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Ser-1le-1le-Ser-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列17)。
[0134]如上所述，与天然存在的肽a -MSH相比，本发明的肽具有提高的治疗效果和/或提闻的最大响应和/或提闻的最大功效。
[0135]发明人已经检验过了一些本发明的肽的生物学效果:
[0136]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-Hi S-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列I*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，
[0137]Ac- (Glu) 6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-Hi S-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列2*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，
[0138]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-(D-Val)-NH2(序列表序列3*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，
[0139]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-GIy-Ly s-Pro-Va1-NH2(序列表序列5*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，
[0140]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2(序列表序列9*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，
[0141]Ac- (Lys) 6-Ser-Ser-1 Ie-1 Ie-Ser-Hi S-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列13*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，
[0142]Ac- (Lys) 6-Ser-Ser-1Ie-1Ie-Ser-His-(D-Phe)-Arg-Trp-GIy-Ly s-Pro-Va1-NH2(序列表序列17*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)。
[0143]通常，“Ac-”说明本发明的肽在N-端被こ酰化，“-NH2”说明本发明的肽在C-端被
酰胺化。
[0144]在人白细胞悬液中(实验方案I )，所有七个肽剂量依赖地抑制LPS诱导的TNF-a累积(实施例1-7)。令人意外 的是，我们发现与天然促黑素a-MSH相比，所有七个肽是更有效的以及更有效能的，前者由对TNF-a生产的最大抑制效果所定义，后者由提供最大的TNF-a累积抑制所需的化合物浓 度所定义(实施例1-7)。
[0145]在通过静脉注入LPS在大鼠中诱导全身性炎症的方案中(实验方案2)，发明人还研究了以上所列的七个肽的效果(序列表序列I*、序列表序列2*、序列表序列3*、序列表序列5*、序列表序列9*、序列表序列13*、序列表序列17*，所有*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)。我们证实，所述肽极大地抑制了循环血中LPS诱导的TNF-a累积。令人意外的是，所有七个肽(序列表序列I*、序列表序列2*、序列表序列3*、序列表序列5*、序列表序列9*、序列表序列13*、序列表序列17*，所有*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)能抑制循环血中LPS诱导的TNF-a累积到比天然促黑素细胞激素a-MSH更高的程度(实施例1-7)。
[0146]在通过大鼠吸入LPS诱导炎症的方案中(实验方案3)，发明人还研究了如下肽的效果:
[0147]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-Hi S-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列I*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，
[0148]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-GIy-Ly s-Pro-Va1-NH2(序列表序列5*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，
[0149]已经证实这两个肽(序列表序列I*和5*)极大地抑制肺泡内LPS诱导的嗜酸性细胞累积(实施例1和实施例2)。令人意外的是，肽(序列表序列5*)除了这种对嗜酸性细胞的作用外，还显著地抑制嗜中性粒细胞浸润到比在用天然促黑素a-MSH处理的大鼠中发现的程度高很多的程度。
[0150]肾的ー过性局部缺血(temporal ischemia)常常被视为低血压、血容量不足、外科手术介入的結果，所述结果涉及肾和/或大动脉血流量的降低，或者与败血病有夫。这导致局部缺血诱导的急性肾衰竭，对于大部分患者来说其将恶化为慢性肾衰竭。目前还没有出现有效的治疗方法来防止肾衰竭的发展。在局部缺血后阶段常见发现是尿浓缩缺陷的发展，所述尿浓缩缺陷具有提高的无溶质尿(solute free urine)产量的形成。
[0151]人们已经知道，由局部缺血和再灌注诱导的大鼠的局部缺血诱导的实验性急性肾衰竭(ARF)引起与尿浓缩机制的损害相关的肾小管上皮细胞的特征性结构改变。这个局部缺血诱导的ARF模型提供了合适的模型来评价在局部缺血诱导的损伤中MSH类似物的效果。在由暂时双向阻塞肾动脉诱导的重症急性肾衰竭中，本发明人已经研究了肽Ac-(Lys)
6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-HiS-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列 I* 在 N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)的效果，并且将其与天然肽a -MSH的效果进行了比较(实验方案6)。当暂时阻塞肾动脉之后5天进行评价时，以载体处理的大鼠发展为多尿症(由比对照大鼠高101%的多尿量所定义)，所述对照大鼠进行假的肾动脉阻塞。令人意外的是，服用与天然肽a-MSH相同的摩尔量的所述化合物(序列表序列I*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)完全使多尿量正常化，这说明所述肽具有保护避免局部缺血诱导的ARF的能力，而在该模型中用天然肽处理不能使尿生产正常化。
[0152]在发达国家中急性心肌梗塞(AMI)是最常见的死亡原因之一。由于突然的冠状动脉血栓症，AMI几乎总是发生在具有冠状动脉的患者中。目前，纤维蛋白溶解疗法或初期经皮冠状动脉腔内成形术(PTCA)是标准的治疗方法，能够在50-70%的病人中获得早期再灌注(自发的再灌注率小于30%)。再灌注的目的是减小梗塞的大小，从而降低被损坏的心肌功能的发展。纤维蛋白溶解/PTCA的全部效果是短期和长期死亡率下降20%。然而，AMI伴随有炎症反应，这对于愈合和瘢痕形成来说是先决条件。冠状动脉阻塞严重地减小了到心肌部分的血流量，这显著地损害了能量代谢。局部缺血持续相当长的时间( 20min)引起梗塞并且导致炎症反应，当再灌注局部缺血心肌时两者都会加速和扩大。
[0153]心肌缺血/再灌注(MIR)不仅激活对嗜中性粒细胞-浸润的典型的炎症再灌注反应，而且激活心肌细胞因子的基因表达，所述细胞因子包括肿瘤坏死因子-a (TNF- a )、白介素(1し)-10、1レ6、1レ8、干扰素-￥和胞间粘附分子_1 (ICAM-1)。细胞因子的这种局部心肌过表达不仅在梗塞面积的调节上而且在心肌机能障碍(包括血管壁重作、心カ衰竭和心脏肥大)的发展上起重要作用。此外，人们认为，通过直接抑制收缩性和诱导细胞凋亡，局部生成的TNF-a促成缺血后器官机能障碍。
[0154]越来越多的实验研究已经证实抗炎/抗氧化/抗细胞凋亡策略具有减小MIR动物模型的梗塞面积的能力。然而，没有临床研究证实在人类中的显著效果。
[0155]在大鼠的心肌缺血/再灌注模型中，在所述模型中左前冠状动脉被阻塞60分钟，恰好在去掉冠状动脉阻塞之前给予用根据本发明的肽的处理，然后再跟踪大鼠3小吋。然后评价所述肽减小梗塞面积的能力，并将其与天然肽a-MSH的效果进行比较(实验方案5)。
[0156]令人意外的是，所有如下三个肽:
[0157]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-Hi S-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列I*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，
[0158]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-GIy-Ly s-Pro-Va1-NH2(序列表序列5*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)，和[0159]Ac- (Lys) 6-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2(序列表序列9*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)减小梗塞面积到比天然肽a -MSH更高的程度(实施例1、3-4)。
[0160]根据上面以及实施例所描述的肽的功能特性，本发明涉及具有至少ー种如下特性的肽:
[0161]a)抑制LPS诱导的TNF-a的产生，其中TNF-a由人白细胞产生
[0162]b)抑制肺中炎症诱导的嗜酸性细胞浸润
[0163]c)抑制肺中炎症诱导的嗜中性粒细胞浸润
[0164]d)抑制循环血中炎症诱导的TNF-a累积
[0165]e)减轻局部缺血诱导的急性肾衰竭
[0166]f)减小心肌梗塞面积
[0167]g)减轻心肌梗塞后心力衰竭的程度
[0168]h)减轻肺血管高血压
[0169]i)减轻顺钼诱导的肾衰竭
[0170]肽可以具有ー个以上这些特性，例如2、3、4、5、6、7、8或者上述所有特性。这些特性能够用如实施例中概述的方法进行检验。
`[0171]如上所述，本发明的a-MSH类似物的特征为具有比天然a-MSH提高的功效。
[0172]在本说明书和权利要求中，术语“功效”被定义为化合物可获得的最大响应。在实施例记载的各种试验中，本发明的a-MSH类似物能够产生比天然a-MSH更高的最大响应。
[0173]优选地，与a -MSH相比，本发明的a -MSH类似物抑制由人白细胞产生的LPS诱导的TNF- a生产最少10%，更优选25%以及最优选40%。
[0174]进ー步，本发明的a -MSH类似物可以抑制肺中炎症诱导的嗜酸性细胞浸润，通过降低支气管肺泡灌洗或者类似方法收集的液体中嗜酸性细胞数量的能力測定。当与a -MSH比较时，我们发现最小预期效果是嗜酸性细胞减少10%，更优选25%以及最优选50%。
[0175]此外，本发明的a-MSH类似物可以抑制肺中炎症诱导的嗜中性粒细胞浸润，通过降低支气管肺泡灌洗或类似方法收集的液体中嗜中性粒细胞数量的能力測定。当与a -MSH比较时，发现最小预期效果是嗜中性粒细胞减少10%，更优选20%以及最优选40%。
[0176]与a-MSH相比，本发明的a-MSH类似物还可以抑制循环血中炎症诱导的TNF-a生产最少10%，更优选25%以及最优选40%。
[0177]此外，本发明的a -MSH类似物可以减轻局部缺血诱导的急性肾衰竭，这通过减轻局部缺血后多尿症程度的能力測定。当与a-MSH比较时，发现最小预期效果是多尿症減少10%,更优选30%以及最优选50%。
[0178]进ー步，本发明的a -MSH类似物可以减小心肌梗塞面积，通过降低局部缺血心肌中坏死面积的大小的能力证明。当与a-MSH比较时，发现最小预期效果是梗塞面积减少10%,更优选20%以及最优选30%。
[0179]在另一方面，本发明的a -MSH类似物可以减轻心肌梗塞后心力衰竭的程度，通过直接測量左心室末端舒张压或类似定量方法评价心脏的表现来证明。当与a-MSH比较时，发现最小预期效果是心力衰竭的程度減少10%，更优选20%以及最优选25%。
[0180]在另一方面，本发明的a-MSH类似物可以减轻肺血管高血压症。当与a-MSH比较时，发现最小预期效果是肺血管高血压症減少10%，更优选20%以及最优选30%。
[0181]在另一方面，本发明的a-MSH类似物可以减轻顺钼诱导的肾衰竭。当与a-MSH比较时，发现最小预期效果是低血镁症(hypomagnesia)和/或肾小球浸润率减少10%,更优选20%以及最优选30%。
[0182]如前所述，天然肽a-促黑素(a-MSH)作为I型、3型、4型和5型黑皮质素(MC)受体的天然激动剂已经为人们熟知，而ACTH是2型受体(MC2)的天然配基。因为所述肽包括a-MSH或其类似物的氨基酸序列，所述肽具有激活ー种或多种黑皮质素受体(即I型、3型、4型或5型黑皮质素受体)的能力。
[0183]本发明肽的制备方法
[0184]本发明的肽可以通过本领域本身熟知的方法进行制备。因而，a-MSH、a -MSH变体、a-MSH类似物和X基元(motif)可以通过标准的肽制备技术(例如溶液合成法或Merrifield型固相合成法)制备。
[0185]在ー个可能的合成策略中，本发明的肽可以通过固相合成法制备:首先使用公知的标准的保护、偶联和脱保护步骤构建药理活性的肽序列(a -MSH、a -MSH变体、a -MSH类似物)，此后在活性肽上用与构建活性肽类似的方式继续偶联基元X的氨基酸序列，最后从载体上切除整个肽。这种策略获得了ー种肽，其中肽序列X在肽的N-端氮原子上被共价结合到该药理活性的肽上。
[0186]另ー可能的策略是通过溶液合成法、固相合成法、重组技术或酶合成法分别制备a -MSH肽/类似物和X-基元(或其部分)的序列，接着在溶液中或者使用固相技术或其组合通过公知的片段缩合步骤偶联两个序列。在一个实施方式中，a-MSH肽/类似物可以通过重组DNA方法制备，X基元可以通过固相合成法制备。a -MSH肽/类似物与X基元的接合可以通过使用化学接合法进行。这种技术允许在高特异性方式下组装完全无保护的肽片段(Liu等，1996)。还可以通过 蛋白酶催化的肽键形成进行所述接合，其提供了ー种高度特异的技术以通过肽键接合完全无保护的肽片段(Kullmann, 1987 )。
[0187]合适的固体支持材料(SSM)的实例是例如功能化的树脂如聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、聚乙二醇接枝的聚苯乙烯、胶乳、戴诺免疫磁珠(dynabeads)等。
[0188]应当理解的是，将X-基元的肽序列的C-端氨基酸或者a-MSH、a-MSH变体、a-MSH类似物的C-端氨基酸通过常用连接子连接到固体支持材料上是必须的或者需要的，常用连接子是例如2，4- 二甲氧基-4’ -羟基-二苯甲酮、4-(4-羟基-甲基-3-甲氧基苯氧基)-丁酸、4-羟基-甲基苯甲酸、4-羟甲基-苯氧基こ酸、3- (4-羟基甲基苯氧基)丙酸、和P-[ (R, S)-a[1-(9H-芴-9-基)甲氧基甲酰胺基]_2，4- 二甲氧基苯基]-苯氧基-乙酸。
[0189]通过酸(例如三氟こ酸、三氟甲磺酸、溴化氢、氯化氢、氟化氢等)任选地与ー种或多种适于该目的的“清除剂”(例如こ二硫醇、三异丙基硅烷、苯酚、苯硫基甲烷等)组合的方法，可以将本发明的肽从固体支持材料上切除，或者，通过碱的方法例如氨、肼、醇盐例如こ醇钠、氢氧化物例如氢氧化钠等，将本发明的肽接合物从固体支持材料上切除。
[0190]本发明的肽也可以通过重组DNA技术使用本领域技术人员熟知的一般方法和原理来进行制备。通过已制定的标准方法例如亚磷酰胺方法(phosphoamidite method),可以合成地制备编码本发明的肽的核酸序列。根据亚磷酰胺方法，例如在自动DNA合成仪中，在合适载体上合成、纯化、退火、连接以及克隆寡核苷酸。
[0191]然后将编码本发明的肽的核酸序列插入到重组表达载体中，所述重组表达载体可以是可以方便地进行重组DNA步骤的任何ー种载体。载体的选择通常依赖于其将要被转入的宿主细胞。因此，所述载体可以是自发复制的载体，即作为染色体外个体存在并且其复制不依赖于染色体复制的载体，例如质粒。此外，所述载体可以是ー种载体，即当被转入到宿主细胞时，载体被整合到宿主细胞基因组内并且与它所整合进入的染色体一起复制。
[0192]在载体中，需要将编码本发明的肽的核酸序列可操作地连接到适当的启动子上。启动子可以是在所选的宿主细胞中显示出转录活性并且可以从编码与宿主细胞同源或者异源的蛋白的基因中导出的任意的核酸序列。用于在哺乳动物细胞中指导编码本发明的肽的核酸序列转录的、合适的启动子的实例是SV40启动子、MT-1 (金属硫蛋白基因)启动子或腺病毒2主要晩期启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子和牛乳头状瘤病毒(BPV)启动子。用在昆虫细胞的适当的启动子是多角体蛋白启动子。
[0193]合适的启动子(其用于指导编码本发明的肽的核酸序列的转录，尤其是在细菌宿主细胞中)的实例是从以下来源获得的启动子:大肠杆菌乳糖操纵子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因(dagA)，枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因(sacB)、地衣芽孢杆菌a -淀粉酶基因5 (amyL)、嗜热脂肪芽孢杆菌麦芽糖淀粉酶基因(amyM)、解淀粉芽孢杆菌a -淀粉酶基因(amyQ)、地衣芽孢杆菌青霉素酶基因(penP)、枯草芽孢杆菌xylA和xylB基因、和原核@ -内酰胺酶基因，以及tac启动子。更多的启动子记载于\"Useful proteins fromrecombinant bacteria\"Scientific American, 1980, 242:74-94;和 Sambrook 等，1989(同前)。
[0194]用于在丝状真菌宿主 细胞中指导编码本发明的肽的核酸序列转录的、合适的启动子的实例是从编码以下酶的基因获得的启动子:米曲霉TAKA淀粉酶、米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)天冬氨酸 蛋白酶、黑曲霉中性a-淀粉酶、黑曲霉耐酸性a-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、米黑根毛霉脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉磷酸丙糖异构酶、构巢曲霉こ酰胺酶、尖孢铼刀菌(Fusarium oxysporum)类胰蛋白酶水解酶(记载于美国专利4，288，627，在此引入作为參考)，以及它们的杂化物。用于丝状真菌宿主细胞的、特别优选的启动子是TAKA淀粉酶、NA2_tpi (来自编码黑曲霉中性a-淀粉酶和米曲霉磷酸丙糖异构酶的基因的启动子的杂化物)和glaA启动子。
[0195]在酵母宿主中，有用的启动子可以从以下基因获得:酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(ENO-1)基因、酿酒酵母半乳糖激酶基因(GALl)、酿酒酵母こ醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(ADH2/GAP)和酿酒酵母3-磷酸甘油激酶基因。用于酵母宿主细胞的其他有用启动子记载于Romanos等1992，酵母(Yeast) 8:423-488。
[0196]编码本发明的肽的核酸序列还可以被可操作地连接到合适的终止子例如人生长激素终止子上。用于丝状真菌宿主细胞的优选的終止子从编码如下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨基苯甲酸盐合成酶、黑曲霉a-葡糖苷酶和尖孢铼刀菌类胰蛋白酶水解酶。
[0197]用于酵母宿主细胞的优选的終止子从编码以下酶的基因获得:酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C (CYC1 )、酿酒酵母こ醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶。用于酵母宿主细胞的其他有用終止子记载于Romanos等1992(同前)。
[0198]所述载体还可以包括元件例如聚腺苷酸化信号(例如，来自SV40或腺病毒5Elb区)、转录增强子序列(例如，SV40增强子)和翻译增强子(例如，编码腺病毒VA RNAs的增强子)。此外，用于丝状真菌宿主细胞的优选的聚腺苷酸化信号从编码以下酶的基因获得:米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、构巢曲霉氨基苯甲酸盐合成酶。用于酵母宿主细胞的有用的聚腺苷酸化信号记载于Guo和Sherman, 1995，分子细胞生物学(MolecularCellular Biology) 15:5983-5990。
[0199]重组表达载体还可以包括能够使所述载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。这种序列(当宿主细胞是哺乳动物细胞时)的实例是SV40或多瘤病毒的复制起点。细菌的复制起点的实例是质粒 pBR322、pUC19、pACYC177、pACYC184、pUBH0、pE194、pTA1060 和 pAM3 I的复制起点。用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点(2micron origin ofreplication), CEN6与ARS4的组合、CEN3与ARSl的组合。复制起点可以是具有突变的复制起点以使在宿主细胞中其功能是温度敏感的(參见Ehrlich，1978，Proc.Natl.Acad.Sc1.USA75:1433)o
[0200]所述载体还可以包括选择性标记，例如其产物补足宿主细胞的缺陷的基因，例如用于编码二氢叶酸还原酶(DHFR)的基因或者赋予对药物抗性的基因，所述药物是例如新霉素、遗传霉素(geneticin)、氨节青霉素、潮霉素(hygromycin)。用于酵母宿主细胞的合适的标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRPI和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记可以选自如下组以及来源其他物种的等同物，所述组包括但不限于amdS (こ酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar (草丁膦こ酰转移酶)、hygB (潮霉素磷酸转移酶)、niaD (硝酸还原酶)、pyrG (乳清酸核苷-5’-磷酸盐脱羧酶)、SC (硫酸盐腺苷转移酶)、trpC (氨基苯甲酸盐合成酶)和草铵膦抗性标记。用于曲霉细胞的优选的选择性标记是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG标记以及吸水链霉菌的bar标记。此外,选择性可以通过共转化完成，例如如W091/17243所记载的，选择性标记在单独的载体上。
`[0201]用于连接分别编码本发明的肽、启动子以及终止子的核酸序列，以及将它们插入到含有复制必须的信息的合适的载体中的步骤，对于本领域技术人员来说是公知的(參照，例如Sambrook等,在引文中列举)。
[0202]表达载体所转入的宿主细胞可以是能够生产本发明的肽的任何细胞，可以是真核细胞，例如无脊椎动物(昆虫)细胞或者脊椎动物细胞(例如爪蟾卵母细胞或哺乳动物细胞)，尤其是昆虫细胞和哺乳动物细胞。合适的哺乳动物细胞系的实例是COS (例如，ATCCCRL1650)、BHK (例如?，ATCC CRL1632, ATCC CCL10)或者 CHO (e.g.，ATCC CCL61)细胞系。
[0203]用于转染哺乳动物细胞以及表达已转入到细胞的DNA序列的方法可以是任何一种本领域熟知的方法(例如，MANIATIS, T.，E.F.FRITSCH 和 J.SAMBR00K, 1982MolecularCloning:A Laboratory Manual.冷泉港实验室出版社,冷泉港，纽约州)。
[0204]宿主细胞还可以是单细胞病原体(例如原核细胞)或者非单细胞病原体(真核细胞)。有用的单细胞细胞是细菌细胞例如革兰氏阳性菌(包括但不限于芽孢杆菌细胞，例如嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短芽抱杆菌(Bacillus brevis)、环状芽胞杆菌(Bacilluscirculans)、凝固芽胞杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽胞杆菌(Bacillus Iautus)、地衣芽抱杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽胞杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热脂肪芽抱杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)以及苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)),或者链霉菌细胞(例如，浅青紫链霉菌(Streptomyces Iividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)),或者革兰氏阴性菌(例如大肠杆菌(E.Coli)和假单胞菌(Pseudomonas sp))。细菌宿主细胞的转化可以例如通过原生质体转化、通过使用感受态细胞、通过电穿孔或者通过融合法进行。
[0205]宿主细胞可以是真菌细胞。这里使用的“真菌”包括子囊菌门(phylaAscomycota)、担子菌门(Basidiomycota)、壶菌门(Chytridiomycota)和结合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有的有丝分裂孢子真菌(mitosporic fungi)。子囊菌门的代表性组包括，如,脉孢菌属(Neurospora)、正青霉菌属(Eupenicillium)(=青霉菌属(Penicillium))、翅孢霉属(Emericella)(=曲霉(Aspergillus))、散囊菌(Eurotium)(=曲霉(Aspergillus))以及下面列出的真正酵母。真菌宿主细胞也可以是酵母细胞。这里所用的“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉科(Endomycetales))、担子孢子形成酵母(basidiosporogenous yeast)以及属于半知菌门(Fungi Imperfecti)(芽孢纲(Blastomycetes))的酵母。用于培养细胞的培养基可以是任何适宜生长哺乳动物细胞的常规培养基(例如含有适当的添加物的含血清培养基或无血清培养基)，或者是用于生长昆虫细胞、酵母细胞或真菌细胞的合适培养基。合适的培养基可以从商业厂商获得或者根据已公开的配方来制备(例如，美国典型微生物菌种保藏中心的目录)。
[0206]然后通过常规方法从培养基中回收由细胞生产的本发明的肽，所述方法包括通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，用盐例如硫酸铵沉淀上清液或滤液的蛋白组分，通过各种色谱法例如离子交换色谱、亲和色谱等纯化。
[0207]因此，本发明涉及用于制备根据本发明的肽的方法，所述方法用重组DNA技术，其包括如下步骤:(a)将编码所述肽的核酸序列转入到宿主细胞中，和(b)培养所述宿主细胞，和(C)从所述培养物中分离所 述肽；或者，(a)在允许所述肽生产的条件下，培养含有编码所述肽的核酸序列的重组宿主细胞，和(b)从所述培养物中分离所述肽。
[0208]用途
[0209]本发明还涉及根据本发明的肽在医药领域的用途，特别是与ー种或多种上面或者下面提到的病况、不适或疾病有关的用途。
[0210]在一个实施方式中，本发明涉及一种或多种根据本发明的肽用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗或预防哺乳动物的一个或多个器官的组织的病况。所述器官选自但不限于由下述所组成的组中:肾、肝、脑、心脏、肌肉、骨髄、皮肤、骨骼、肺、呼吸道、脾、外分泌腺、膀胱、内分泌腺、包括输卵管的生殖器官、眼、耳、血管系统、包括小肠、结肠、直肠及肛管的胃肠道和前列腺。
[0211]如上所述，与a-MSH相比，本发明的肽显示出提高的抗炎效果以及提高的防止局部缺血病况的能力。
[0212]因此，本发明涉及一种或多种根据本发明的肽用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗或预防哺乳动物的一个或多个器官的组织的病况，其中所述病况是局部缺血或炎症病况。所述病况还可以是归因于毒素或药物诱导的细胞、组织或器官的衰竭。
[0213]在本说明书和权利要求中，如果上下文没有特别地排除这种解释，术语“治疗”通常包括已有病况的治疗以及这种病况的预防(预防性治疗)。
[0214]在最宽的方面，本发明涉及任何病况其中器官或组织的正常功能由于局部缺血或炎症而改变。损伤可以包括急性和/或慢性损伤。慢性损伤包括处于器官或组织的完全或部分恢复期间的重复损伤的情形。
[0215]局部缺血
[0216]在本说明书和权利要求中，局部缺血定义为对ー个或多个器官降低的血流量，导致组织降低的氧输送和/或利用。局部缺血可以发生在ー个或多个器官中，所述器官包括(非完全列表(non-listing list)):脑、心脏、四肢、肾、脾、肝、肠、胃、肺、眼、皮肤、肌肉、膜、内分泌器官以及其他。
[0217]通过降低的/完全的阻止动脉血供给，局部缺血诱导许多组织反应包括嗜中性粒细胞累积、其他炎症反应和细胞死亡。局部缺血涉及许多疾病，其与大外科(majorsurgery)相关并且继发于其他重症疾病。鉴定能够抑制或预防(完全地或部分地)许多作为局部缺血的结果而发生的细胞/组织/器官损伤或破坏的化合物是非常有益的。
[0218]进行治疗的病况能够归因于组织的局部缺血或者由组织的局部缺血所产生，例如动脉狭窄症或者任何其他完全的或部分的血供给限制。局部缺血可以是急性的或者慢性的，这依赖于疾病的严重程度，此外，所述病况可以是可逆的或者不可逆的。可逆病况的实例可以归因于在手术或其他介入性治疗过程中血压下降。因此，进行治疗的病况可以是任何系统血流量的降低例如低血压，其将影响对肠、心脏、肾或任何其他器官的系统血流量。
`[0219]在一个实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽用于制备用于治疗局部缺血的药物组合物的用途，其中所述病况是由急性、亚急性或慢性的局部缺血引起的。
[0220]器官或四肢或组织的急性、亚急性或慢性的局部缺血可以由许多疾病引起。其包括(非完全列表)具有血栓形成的动脉粥样化疾病、来自心脏或者来自血管或者来自任何器官的栓塞、痉挛、其他器官的主动脉瘤或动脉瘤、胸或腹或壁间动脉瘤、归因于心脏病的低血压、归因于系统性疾病(包括传染病或过敏反应)的低血压、归因于ー个或多个毒性化合物或毒药或药物的低血压。
[0221]在第二实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽用于制备用于治疗局部缺血的药物组合物的用途，其中所述病况是由继发性局部缺血引起的。
[0222]继发于疾病或病况的局部缺血能够在ー种或多种选自如下的疾病和病况中观察到:糖尿病、高脂血症、闭塞性血栓血管炎(伯格氏病)、高安氏综合征、ー过性动脉炎、皮肤粘膜淋巴结综合征(川崎氏病)、心血管梅毒、如雷诺氏病的结缔组织疾病、蓝色静脉炎、血管创伤(包括医源性创伤例如套管插入木或手术或器官移植)。此外，该列表包括由ー个或多个器官手术、ー个或多个器官移植、手术插入移植、装置、移植物、假肢或其他生物医学化合物或设备引起的局部缺血。
[0223]在第三实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽的用途，其中所述病况是由归因于败血症休克的局部缺血或与系统性低血压相关的病况引起的。
[0224]炎症症状
[0225]术语“炎症症状”在本文中是指ー种病况，在所述病况中例如特异性T淋巴细胞反应或者抗体与抗原的反应的机理引起炎性细胞和内生媒介化学物质的募集。在一些情况下，器官或组织的正常功能由于血管浸润性的増加和/或内脏平滑肌的收缩而改变。这种炎症病况会产生炎症疾病。
[0226]在一个实施方式中，本发明涉及一种或多种根据本发明的肽用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗或预防哺乳动物的一个或多个器官的组织的病况，其中所述病况是炎症病况。[0227]炎症病况可以由炎症疾病引起，其包括(非完全列表):关节炎(包括与关节炎有关的疾病)、骨关节炎、类风湿性关节炎；脊柱关节病(例如強直性脊柱炎)、反应性关节炎(包括风湿热之后的关节炎)、过敏性紫癜和Reiter病。此外，炎性疾病包括结缔组织疾病例如系统性红斑狼疮、多肌炎/皮肤肌炎、系统性硬化、混合型结缔组织病、肉状瘤病和原发性舍格伦综合征(包括干燥性角膜結膜炎)、风湿性多肌痛、和其他类型的血管炎、结晶沉积症(包括痛风)、焦磷酸性关节病、急性钙化性关节周围炎。此外，炎性疾病包括幼年型关节炎(斯提耳氏病)、牛皮癣、骨关节炎、继发于过度移动症的骨关节炎、先天性发育不良、股骨头骺松脱、派尔特斯病(Perthes’ disease)、关节内骨折、半月板切除术、肥胖症、复发性脱位、重复性动作、结晶沉积症和软骨代谢异常症(包括焦磷酸性关节病)、褐黄病、血色素沉积症、缺血性坏死(包括铼刀型细胞病)、用肾上腺皮质激素或其他药物的治疗法、减压病、败血性或感染性关节炎(包括结核性关节炎、脑膜炎双球菌性关节炎、淋菌性关节炎、沙门氏菌性关节炎)、感染性心内膜炎(包括由绿色链球菌、粪肠球菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、组织胞浆菌属、布鲁氏菌属、念珠菌属、曲霉属和贝钠氏考克期体(Coxiellaburnetii)引起的心内膜炎)、病毒性关节炎(包括感染有风疹、流行性腮腺炎、こ型肝炎、HIV或细小病毒)，或再发性关节血肿。此外，炎症疾病包括血管炎例如归因于感染有细菌的感染性血管炎，包括螺旋体疾病如拉姆病、梅毒、立克次氏体和分枝杆菌感染、真菌、病毒或原虫感染。此外，炎症疾病包括非感染性血管炎，包括高安氏病、巨细胞性动脉炎(一过性动脉炎和风湿性多肌痛)、伯格氏病、结节性多动脉炎、显微镜下多动脉炎、韦格纳肉芽肿、变应性肉芽肿性血管炎(Churg-Strauss综合征)、继发于结缔组织疾病的血管炎包括系统性红斑狼疮、多肌炎/皮肤肌炎、系统性硬化、混合型结缔组织病、肉状瘤病和原发性舍格伦综合征。此外，炎症疾病包括继发于风湿性关节炎的血管炎。
[0228]此外，炎症疾病包括继发于过敏症的非感染性血管炎和白细胞增多性血管炎包括血清病、过敏性紫癜、药物诱导的血管炎、特发性混合性冷球蛋白血症、低补体血症、与其他恶性肿瘤联发的血管炎、炎症性肠病、原发性胆汁性肝硬化、肺出血肾炎综合征(古德帕斯JX综合征 Goodpasture syndrome 入
[0229]此外，炎症疾病包括所有类型的儿童关节炎，例如幼年型关节炎包括斯提耳氏病，幼年型类风湿关节、幼年型強直性脊柱炎。
[0230]此外，炎症疾病包括上气道病和下气道病例如慢性阻塞性肺病(C0PD)、变应性气喘和非变应性气喘、变应性鼻炎、过敏性和非过敏性結膜炎。此外，炎性疾病还包括过敏性或非过敏性皮炎。
[0231 ] 此外炎症疾病包括所有类型的沉积病，如痛风、焦磷酸性关节病、急性钙化性关节周围炎。
[0232]此外炎症疾病所有类型的产生背痛的炎症病况包括感染、败血性关节盘炎、结核病、恶性肿瘤(例如转移性肝肿瘤、骨髓瘤以及其他)、脊柱肿瘤、强直性脊柱炎、急性盘间突出、慢性盘间疾病/骨关节炎、骨质疏松症、软骨病。它还包括变形性骨炎、甲状旁腺机能亢进、肾病性骨营养不良、脊椎前移、锥管狭窄症先天性异常和纤维肌痛。
[0233]此外炎症疾病包括所有类型的软组织风湿病包括滑囊炎、腱鞘炎或腱膜炎、肌腱末端炎、神经挤压症、关节周炎或囊炎、肌肉紧张和肌肉功能失调。
[0234]此外炎症疾病包括胃肠道系统的炎症疾病(包括所有类型的胃炎、天疱疮、大疱类天疱疮、良性粘膜性类天疱疮)、唾液腺疾病(例如肉状瘤病、唾液管堵塞和舍格伦综合征)、食道炎症(例如胃食管反流性疾病或感染有念珠菌属物种、单纯性疱疹和巨细胞病毒)、胃的炎症疾病(包括急性和慢性胃炎、幽门螺杆菌感染、肥大性胃炎)、小肠的炎症(包括腹腔病、麸质过敏性肠病、疱疹样皮炎、热带性腹泻、惠普尔病、放射性肠炎、系统性淀粉样变病、结缔组织疾病包括系统性红斑狼疮、多肌炎/皮肤肌炎、系统性硬化、混合型结缔组织病和肉状瘤病)、嗜酸性胃肠炎、小肠淋巴管扩张症、炎症性肠病(包括克罗恩病和溃疡性结肠炎)、结肠憩室病、和肠易激综合征。
[0235]在优选的实施方式，本发明涉及一种或多种根据本发明的肽用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗或预防哺乳动物的一个或多个器官的组织的病况，其中所述病况是选自肺炎、关节炎、皮炎、胰腺炎和炎症性肠病的炎症病况。
[0236]药物诱导的细胞、组织和器官衰竭
[0237]在一个实施方式，本发明涉及一种或多种根据本发明的肽用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗或预防毒素或药物诱导的细胞、组织或器官衰竭。
[0238]在本说明书和权利要求中，“药物诱导的细胞、组织或器官衰竭”定义为由药理学化合物诱导的细胞或组织功能 和/或形态上的变化。所述药理学化合物包括但不限于癌化疗药包括顺钼、卡钼、达卡巴嗪(dacarbezine)、丙卡巴肼、六甲基蜜胺、司莫司汀、洛莫司汀、卡莫司汀、白消安、噻替哌、美法仑、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、二氯甲基二こ胺、阿扎胞苷、克拉曲滨、阿糖胞苷、氟拉达滨、巯嘌呤、甲氨碟呤、硫鸟嘌呤、别嘌呤醇、博来霉素、更生霉素、正定霉素、多烯紫杉醇、阿霉素(亚德里亚酶素)、足叶こ甙、伊达比星、伊立替康、丝裂霉素、紫杉醇、普卡霉素、拓扑替康、长春花碱、长春新碱、长春瑞宾、阿玛萨克瑞恩(amasacrine)、天门冬酰胺酶、羟基脲、咪替他恩(mititane)、米托蒽醌；如氨基糖苷类的抗生素包括链霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素、托普霉素、西索米星、奈替米星；免疫抑制化合物如环孢霉素、三环类抗抑郁药、锂盐、普尼拉明和吩噻嗪类衍生物。
[0239]其中细胞、组织或器官的正常功能已经被改变的病况包括与如下疾病相关的病况:局部缺血、急性和/或慢性炎症、过敏性反应、风湿病、感染(包括病毒、真菌、细菌感染)、蛋白感染素和其他微生物和本领域熟知的其他感染性制剂、所有形式的毒性反应(包括药物诱导的毒性)、和急性与慢性损伤。慢性损伤包括随器官或组织功能的完全或部分复原的时间变化的重复性损伤的情形。其中细胞、组织或器官的正常功能已改变的病况包括损伤，其与ー个或多个器官或者用于移植的其他装置的植入相关，并且可以预期本发明的肽也将在所述病况的治疗或预防中有用。所述器官可以来源于个体自身、动物体自身或者来源于其他个体或动物。这包括:器官移植、骨移植、软组织植入(硅酮植入)、金属和塑料植入，或者其他医学上可移植的装置。所述个体代表人以及其他哺乳动物。
[0240]进行治疗的病况也可以是由癌症或者由具有对器官(例如对呼吸系统包括肺、细支气管、上气道，和/或对心脏和/或对肾和/或对胃肠系统)影响的癌前病变引起的，包括急性白血病、慢性粒细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、霍奇金病、淋巴肉瘤、骨髄瘤、任何病原的转移性恶性肿瘤。可以预期本发明的肽也将在所述病况的治疗或预防中有用。
[0241]此外，进行治疗的病况也可以是由任何一种选自如下的疾病引起的:糖尿病、具有提高的空腹LDL-胆固醇水平的病况、具有组合提高的空腹LDL-胆固醇和甘油三酯水平的病况、具有提高的空腹甘油三酯水平的病况、具有提高的空腹HDL-胆固醇水平的病况、腹膜后纤维化、红斑狼疮、多结性动脉炎、硬皮病、多发性肌炎、皮肌炎、风湿性关节炎、过敏症、血清病、溶血性贫血和过敏性粒细胞缺乏症。可以预期本发明的肽也将在所述病况的治疗或预防中有用。
[0242]许多导致性能降低的感染可能具有对组织的影响作用并且干扰正常的功能，其可以通过给予有效剂量的本发明的肽来进行改善。这些感染包括原生动物、病毒、细菌和真菌感染，以及包括病况例如AIDS、细菌性败血症、系统性真菌感染、立克次体病、中毒性休克综合征、感染性单核细胞增多症、沙眼衣原体、鹦鹉热衣原体、巨细胞病毒感染、弧形杆菌、沙门氏菌、流感、脊髓灰质炎、弓形虫病、拉沙热病、黄热病、血吸虫病、大肠杆菌、肠球菌、变形杆菌(preteus)、克雷伯氏菌属、假单胞菌、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白色念珠菌、结核病、腮腺炎、感染性单核细胞增多症、肝炎和柯萨奇病毒。
[0243]进行治疗的病况可以与涉及ー种或多种毒性物质和/或药物的化学外伤有夫。这些药物包括三环类抗抑郁药、锂盐、普尼拉明和吩噻嗪类衍生物，癌症化疗药包括顺钼、卡钼、达卡巴嗪(dacarbezine)、丙卡巴肼、六甲基蜜胺、司莫司汀、洛莫司汀、卡莫司汀、白消安、噻替哌、美法仑、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、二氯甲基二こ胺、阿扎胞苷、克拉曲滨、阿糖胞苷、氟拉达滨、巯嘌呤、甲氨碟呤、硫鸟嘌呤、别嘌呤醇、博来霉素、更生霉素、正定霉素、多烯紫杉醇、阿霉素((亚德里亚酶素)、足叶こ甙、伊达比星、伊立替康、丝裂霉素、紫杉醇、普卡霉素、拓扑替康、长春花碱、长春新碱、长春瑞宾、amasacrine、天门冬酰胺酶、羟基脲、mititane、米托蒽醌；如氨基糖苷类的抗生素包括链霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那霉素、庆大霉素、托普霉素、西索米星、奈替米星；免疫抑制化合物如环孢霉素。物理外伤包括电磁辐射也可以引起损伤，能够通过施用有效剂量的根据本发明的a-MSH类似物使其减轻。
[0244]根据本发明进行治疗的病况还可以包括结缔组织疾病例如硬皮病、系统性红斑狼疮，或者神经肌病，例如杜兴(Duchenne)型进行性肌营养不良症、弗里德赖希(Friedreich)共济失调、肌強直性营养不良。所述病况可以例如涉及哺乳动物肠的组织。
[0245]本发明涉及根据本发明的肽的用途，其中所述病况选自由如下所组成的组中:心肌缺血、心绞痛、心包炎、心肌梗塞、心肌缺血、心肌炎、粘液性水肿(myxodemia)、心内膜炎。
[0246]在一个实施方式中，本发明涉及根据本发明的肽的用途，其中所述病况与心律失常相关。
[0247]治疗方法
[0248]本发明还涉及用于治疗或预防在其需要的哺乳动物个体的ー个或多个器官的组织的病况的方法，所述方法包括给予有效剂量的一种或多种根据本发明的肽。所述病况可以是局部缺血症状或炎症病况和/或来自中毒或药物治疗的毒性作用的結果。
[0249]对由任何ー种器官或脉管移植产生的或与之相关的病况,包括防止移植物对宿主的反应，本发明的治疗方法是特异有效的。在这些病况中，整个器官对关于营养、代谢、灌注等的所有变化极度敏感，并且我们相信，根据本发明的治疗能稳定所述病况并且使所述组织对任何压迫器官的功能的情形更有抗性。根据本发明的方法还包括在移植到受体的过程中给予器官移植物有效剂量的本发明的肽，包括添加有效剂量的本发明的肽到移植基质中。
[0250]此外，本申请提供了证据，在重度疾病(例如心肌缺血)中用根据本发明的a -MSH类似物治疗显著地防止了死亡以及器官功能失调。
[0251]最常见的心脏病况之一是间歇性心绞痛或胸痛，其中根据本发明的治疗是特异有效的。涉及心绞痛的病况包括不稳性心绞痛、稳定性心绞痛和Prinzmetal变异型心绞痛。
[0252]在另一方面,可以在由心包炎、心肌梗塞、心肌缺血、心肌炎、myxodemia、心内膜炎引起的情形中利用所述预防和治疗。
[0253]进行治疗的病况可以与心律失常相关，其或者是原发性疾病或者是继发于个体的另ー病况。心律失常的各种原因的实例包括急性感染(特别是那些影响肺的急性感染)、肺栓塞、低血压、中风、血液缺氧症或者能够加速心肌缺血并且从而引起心律失常的贫血症。心律失常会恶化循环障碍并且从而建立起错误的、能使自身永久存在的循环。
[0254]我们相信，根据本发明的治疗将增加用于发展心律失常的阈值，从而防止心律失常的发展。通过直接地对输送系统作用或者间接地通过对引导或者是心律失常的原因的病况进行作用可以实现所述效果。
[0255]能够根据本发明方法减轻的综合症或者心律失常可以是原发性的或者是继发性的，可以选自:室性快速性心律失常或上室性快速性心律失常、房室传导阻滞、窦房结疾病、Wolff-Parkinson-White综合症、Len6gres疾病、Lev疾病以及任何涉及心房和心室之间不正常心肌连接的综合症。
[0256]g在抑制心律失常的抗心律失常治疗法常常伴随有产生新的心律失常的危险。心律失常可以作为归因于超剂量药物毒性反应发生。然而，尤其是在用被称为IA类药物的药物组治疗的过程中，心律失常可以作为非剂量依赖的副作用(特异质反应-在药物浓度在有效药浓度范围内的情况下发展)发生。根据另ー实施方式，病况可以是由ー种或多种抗心律失常药物引起的，包括洋地黄、奎尼丁、丙吡胺、腺苷、阿普林定、氟卡尼、胺碘酮、索他洛尔、美西律、(6-阻滞剂、维拉帕米。
[0257]可以预期用根据本发明的a -MSH类似物进行治疗将降低发展心律失常的危险，心律失常是由于用其他抗心律失常药物的伴生治疗而产生的。
[0258]在本发明的另一方面，病况可以是特征为ー个或多个通过心电图扫描法(ECG)测量的异常。ECG上的异常可以涉及选自ー个或多个选自如下构型改变的变化:P波、ST片段、T波、QRS复合波、Q波、A波和U波。
[0259]可以通过给予有效剂量的根据本发明的肽减轻的其他病况是器官(例如心脏)电解质混乱以及自身混乱，包括一种离子对另ー种离子的相对浓度的异常。该病况包括ー种或多种电解质的异常血清浓度，所述电解质选自如下所组成的组中:钾、钙、钠和镁。
[0260]根据本发明，可以被影响的组织包括存在于器官的ー个或多个细胞类型，可以选自:上皮细胞、巨噬细胞、网状内皮系统单核细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、T-细胞、B-细胞、肥大细胞、树突状细胞。尤其是，T-细胞、B-细胞和肥大细胞在这一方面是有特别意义的。
[0261]本发明的优选的方面涉及预防或治疗，其中预防性地给予根据本发明的a-MSH类似物的剂量用于防止病况或者病况的任何征兆的发展。
[0262]预防的或预防性的治疗可以是在例如手术过程中正在进行的治疗或者是用于防止患冠状动脉狭窄的患者的心脏病发作。预防治疗还可以用于短时期。本领域技术人员能够基于紧急情况评价具体的治疗程序。在优选的实施方式，所述治疗或预防能够减小局部缺血冠状动脉的梗塞面积。与未治疗的个体相比，这种梗塞面积可以减小20%，例如至少30%，优选地至少50%。
[0263]因此，预防性地给予根据本发明的a -MSH类似物的剂量用于防止病况或者病况的任何征兆的建立。
[0264]根据本发明的a -MSH类似物的剂量可以作为单剂量、规则的或者连续的给药，或者作为顺序的给药而进行给予。
[0265]给药可以是全身性给药、局部给药包括药物靶系统的应用、导管和植入、ロ服给药、肠胃外给药，例如皮下给药、肌内注射、静脉注射、腹腔注射、鞘内注射、肺部给药例如通过吸入、外用、粘膜给药、经皮给药。
[0266]因此，给药包括全身性给药；注射到组织或者到体腔内包括关节；植入到组织或者到体腔内；外用到皮肤或者到任何胃肠表面，或者到粘膜表面包括体腔村里。
[0267]因为从上面可以很明显地看出，本发明涉及根据本发明的肽用于制备药物的用途，所述药物通过任何一种相关的给药途径用于治疗或预防本文所公开的任何ー种病况。
[0268]药物制剂和组合物
[0269]本发明还涉及包括一种或多种根据本发明的肽的药物组合物。所述药物组合物还可以包括ー种或多种药物载体。进ー步，所述药物组合物还可以包括一种或多种药学可接受的赋形剂。
[0270]根据本发明的药物组合物可以是，但不限于肠胃外组合物、ロ服组合物、外用组合物、经粘膜组合物或者经皮组合物。
[0271]在以下实施例中，给出了含有一种或多种根据本发明的肽的合适的组合物。对于给个体(动物或人)给药，物质优选制成药物组合物，其含有所述物质以及任选的ー种或多种药学可接受的赋形剂。
[0272]组合物可以以例如固态、半固态或流体组合物的形式存在比如，例如但不限于，可生物吸收片、浸湿物、敷料、水凝胶敷料、水状胶体敷料、薄膜、泡沫、薄片、绷带、膏药、输送装置、植入物、粉剂、颗粒、小颗粒、胶囊、琼脂糖或脱こ酰壳多糖珠、片剂、丸剤、小球、微胶囊、微球、纳米颗粒、喷洒剂、气雾剂、吸入装置、凝胶、水凝胶、糊剂、软膏、乳膏、皂、栓剂、维吉托瑞(vagitorie)牙膏、溶液、分散液、悬浮液、乳状液、混合物、洗液、漱ロ液、洗发精、灌肠剂、试剂盒，所述试剂盒包含例如两个分开的容器，第一个容器含有根据本发明的肽，第二个容器含有适当的介质以备在使用前加入到第一个容器以获得待用的组合物；以及其他一些合适的形式，例如植入物或植入物涂层或一种适合于植入和移植条件下使用的形式。
[0273]组合物可以通过常规的制药方法进行制备，參见例如\"Remington:药剂学的科学和实践 U\'he science and practice of pharmacy；弟二版? Mack Publishing, EastonPA, 2000ISBN0-912734-04-3” 和〃制药技术百科全书(Encyclopedia of PharmaceuticalTechnology) 〃，Swarbrick, J. J.C 编辑.Boylan,Marcel Dekker, Inc., NewYork,1988ISBN0-8247-2800-9.[0274]含有活性物质的药物组合物用作药物输送系统。在本文中术语“药物输送系统”表示一种药物组合物(药物制剂或剂型)，其在给药时代表对人体或动物体的活性物质。因此，术语“药物输送系统”包含普通的药物组合物例如乳膏、软膏、液体、粉末、片剂等，以及更复杂的剂型例如喷雾剂、膏药、绷带、敷料、装置等。
[0275]如上所述，用于根据本发明的用途的药物组合物可以包括药学或美容学可接受的赋形剂。
[0276]在用于根据本发明的用途的组合物中，药学可接受的赋形剂的选择及其最佳浓度一般不能预知，需要基于其实验测定进行确定。一种药学可接受的赋形剂是否适合用于药物组合物中一般还依赖于所选择的剂型的类型。然而，制药领域的普通技术人员能够在
Remmgton:The science and practice oi pharmacy 果二te.Mack Publishing, EastonPA, 2000ISBN0-912734-04-3” 找到指导。
[0277]药学可接受的赋形剂是对组合物将要给予的个体基本无害的物质。这种赋形剂通常要满足药品管理部门颁布的要求。官方药典例如英国药典、美国药典和欧洲药典都规定了公知的药学可接受的赋形剂的标准。
[0278]以下给出了用于根据本发明的用途的相关的药物组合物的综述。该综述是基于特定的给药途径。然而，应理解的是，在那些药学可接受的赋形剂可以不同的剂型或组合使用的情形下，特定的药学可接受的赋形剂的应用并不限于特定剂型或该赋形剂的特定功能。
[0279]肠胃外组合物
[0280]对于全身性应用，根据本发明的组合物可以含有常规的无毒性的药学可接受的载体和赋形剂,包括微球和脂质体。`
[0281]根据本发明使用的组合物包括所有形式的固态、半固态和流体组合物。特定相关的组合物是，例如溶液、悬浮夜、乳液、凝胶、植入片以及植入物。
[0282]药学可接受的赋形剂可以包括，溶剤、缓冲剂、防腐剂、湿润剂、鳌合剂、抗氧化剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、胶凝剂、稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂以及润湿剂。不同试剂的
实例參考如下。
[0283]局部组合物、经粘膜组合物以及经皮组合物
[0284]对于对粘膜或皮肤的应用。用于根据本发明的用途的组合物可以含有通常无毒的药学可接受的载体和赋形剂，包括微球和脂质体。
[0285]用于根据本发明的用途的组合物包括所有形式的固态、半固态和流体组合物。特定相关的组合物是，例如，糊剂、软膏、亲水软膏、乳膏、凝胶、水凝胶、溶液、乳液、悬浮夜、洗剂、擦剂、里索瑞布赖特(resoriblet)、栓剂、灌肠剂、阴道栓剂、模制阴道栓剂、阴道胶囊、阴道片剂、洗发剂、者哩、皂剂、粘贴物、喷雾剂、粉剂、薄膜、泡沫、垫料、海绵(例如胶原海绵)、垫、敷料(如，例如吸收性伤ロ敷料)、浸湿剂、绷带、膏药以及经皮输送系统。
[0286]药学可接受的赋形剂可以包括溶剤、缓冲剂、防腐剂、湿润剂、鳌合剂、抗氧化剂、稳定剂、乳化剤、悬浮剂、胶凝剂、软膏基质、栓剂基质、浸润增强剂、香料、皮肤保护剂、稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂以及润湿剂。不同试剂的实例參考如下。
[0287]ロ服组合物[0288]对于对粘膜或皮肤的应用。用于根据本发明的用途的组合物可以含有通常无毒的药学可接受的载体和赋形剂，包括微球和脂质体。
[0289]用于根据本发明的用途的组合物包括所有类型的固态、半固态和液态组合物。特定相关的组合物是例如溶液、悬浮液、乳液、裸片、控释片、肠溶片、ロ分散片、泡腾片、咀嚼片、软胶囊、硬胶囊、控释胶囊、肠溶胶囊、裸颗粒、泡腾颗粒、用于制备ロ服使用的液体的颗粒、包膜颗粒、肠溶颗粒、控释颗粒、用于ロ服给药的粉剂以及用于制备ロ服使用的液体的粉剂。
[0290]药学可接受的赋形剂可以包括溶剤、缓冲剂、防腐剂、湿润剂、鳌合剂、抗氧化剂、稳定剂、乳化剂、悬浮剂、胶凝剂、稀释剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂以及润湿剂。不同试剂的实例參考如下。
[0291]各种试剂的实例
[0292]溶剂的实例是但不限于水、酒精、植物油或鱼油，(例如，食用油，如杏仁油、蓖麻油、可可油、椰子油、玉米油、棉籽油、亚麻子油、橄榄油、棕榈油、花生油、罂粟籽油、菜籽油、芝麻油、大豆油、向日葵油、以及茶子油)、矿物油、脂肪油、液体石蜡、聚乙二醇、丙二醇、甘油、液体聚烷基硅氧烷，和其混合物。
[0293]缓冲剂的实例是但不限于柠檬酸、こ酸、酒石酸、乳酸、磷酸、二こ胺等。
[0294]用于组合物的防腐剂的实例是但不限于对羟基苯甲酸酯类(例如对羟基苯甲酸甲酷、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酷、对羟基苯甲酸丁酷、对羟基苯甲酸异丁酯、对羟基苯甲酸异丙酷)、山梨酸钾、山梨酸、苯甲酸、苯甲酸甲酯、苯氧こ醇、溴硝丙二醇、布洛尼道克斯(bronidox)、MDM海因(MDM hydantoin)、碘代丙炔基丁基氨基甲酸酯、こ二胺四こ酸(EDTA)、苯扎氯铵和苯甲醇，或者防腐剂混合物。
[0295]湿润剂的实例是但不限 于甘油、丙二醇、山梨醇、乳酸、脲，和相应的混合物。
[0296]鳌合剂的实例是但不限于EDTA钠盐和柠檬酸。
[0297]抗氧化剂的实例是但不限于丁基羟基茴香醚(BHA)、抗坏血酸及其衍生物、生育酚及其衍生物、半胱氨酸，以及其混合物。
[0298]乳化剂的实例是但不限于天然存在的树胶，例如阿拉伯树胶或黄芪胶，天然存在磷脂例如大豆卵磷脂；山梨糖醇酐单油酸酯衍生物；羊毛脂；羊毛脂醇；山梨糖酯；单甘油酷；脂肪醇；脂肪酸酷(例如脂肪酸的甘油三酸酷)；及其混合物。
[0299]悬浮剂的实例是但不限于纤维素以及纤维素衍生物，例如羧甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素，角叉菜胶、阿拉伯树胶、阿拉伯胶、黄芪胶，以及它们的混合物。
[0300]凝胶基质以及粘性增强剂的实例是但不限于液体石蜡、聚乙烯、脂肪油、胶体二氧化硅或胶体铝、锌皂、甘油、丙二醇、黄芪胶、羧乙烯基聚合物、硅酸镁铝、聚羧乙烯
(Carbopoi? )、亲水性聚合物，例如淀粉或纤维素衍生物例如羧甲基纤维素、羟乙基纤维
素，以及其他纤维素衍生物，水溶胀性水解胶体、角叉菜胶、透明质酸盐(例如任选地含有氯化钠的透明质酸凝胶)，和海藻酸盐(包括丙二醇海藻酸盐)。
[0301]软膏基质的实例是但不限于蜂蜡、石蜡、鲸蜡醇、鲸蜡醇十六酸酷、植物油、失水山梨糖醇脂肪酸酷(斯潘Span)、聚乙二醇、以及失水山梨糖醇脂肪酸酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚环氧乙烷失水山梨醇单油酸酯(吐温Tween)。[0302]疏水性软膏基质的实例是但不限于石蜡、植物油、动物脂肪、合成甘油酷、蜡、羊毛脂以及液体聚烷基硅氧烷。
[0303]亲水性软膏基质的实例是但不限于固态macrogols (聚乙二醇)。
[0304]粉末组分的实例是但不限于海藻酸盐、胶原、乳糖，当应用到伤ロ时能够形成凝胶的粉末(吸收液体/伤ロ渗出液)。
[0305]稀释剂以及崩解剂的实例是但不限于乳糖、蔗糖、淀粉-糖类复合物(emdex)、磷酸钙、碳酸钙、硫酸钙、甘露醇、淀粉以及微晶纤维素。
[0306]粘合剂的实例是但不限于蔗糖、山梨醇、阿拉伯树胶、海藻酸钠、明胶、淀粉、纤维素、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮和聚乙二醇(Polyetyleneglycol)o
[0307]润湿剂的实例是但不限于十二烷基硫酸钠和聚山梨酯80。
[0308]润滑剂的实例是但不限于滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、氧化硅、棕榈酰硬脂酰甘油酯(precirol)和聚乙二醇。
[0309]包膜剂的实例是但不限于羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、こ基纤维素和聚甲基丙烯酸酷。
[0310]栓剂基质的实例是但不限于可可豆油、混合脂肪酸甘油酯以及聚乙二醇。
[0311]a-MSH类似物可以以药剂重量的0.001-99%的量存在于药剂中，优选为0.01-75%，更优选为0.1_20%，尤其是1-15%例如ト10%。
[0312]剂量依赖于进行治疗的病`况。各种药物可以在本领域熟知的剂量下使用。可以预期的是，一种或多种根据本发明的肽的剂量在Ing-lOOmg/kg体重的范围，优选为I U g-10mg/kg体重,更优选为10 u g-lmg/kg体重,例如50-500 u g/kg体重。
[0313]在另一方面，本发明涉及如上所述的药物组合物，其包括一种或多种根据本发明的肽以及任选药学可接受的载体。
[0314]可以通过使用本领域熟知的常规技术和常规的药学载体来制备根据本发明的药物组合物。此外，药物组合物可以是适于本文所描述的任一用途的任意形式。
[0315]本文记载并且要求保护的发明并不限于本文所公开的【具体实施方式】的范围，因为这些实施方式是用来说明本发明的几个方面的。任何等同实施方式都在本发明的范围内。实际上，除了本文已经显示和描述的那些修改之外，从上述说明书本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将变得显而易见。这些修改也落入后附的权利要求的范围。
[0316]本文引用了各种參考文献，将其公开的内容以它们整体的方式并入本文作为參考。
[0317]贯穿本说明书，单词“包括”，或其变形例如“包括”或“包含”应当理解为指含有指出的元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组，但并不排除任何其他的元素、整数或步骤，或者元素、整数或步骤的组。
[0318]关于本发明的各种方面的上述说明书以及这些方面的【具体实施方式】，应该理解的是，上述描述或提到的、与本发明的ー个方面和/或ー个方面的一个实施方式相关的任一特征和特性通过类推也适于本发明所描述的任何或者所有的其他方面和/或实施方式。
[0319]以下将通过以下无限制作用的附图和实施例来描述本发明。
[0320]实施例[0321]以下概括描述了用于试验本发明的肽的方法。试验过的肽的结果在实施例1-7中给出。方法的目标是试验本发明的肽用于抗炎效果以及抑制或防止作为局部缺血、炎症或药物的毒性作用的结果而发生的细胞/组织/器官损伤或破坏的能力。
[0322]炎症反应或者慢性炎症的恶化的特征是细胞源性介质(例如肿瘤坏死因子-a(TNF-a )、白介素(IL-1 P、IL-8)、氧化氮(NO)和氧自由基)的生产，这最终会诱导出分布广泛的内皮损伤，所述内皮损伤具有全身脉管的动脉张カ损失、提高的毛细管浸润性、持续的低血压以及器官功能失调，其在肺中伴随有在肺泡腔内的白细胞累积(包括嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞)。通过诱导包括TNF-a的炎症介质，从感染物释放出来的脂多糖(LPS)在对感染的炎症反应方面起重要作用。因此，具有抑制TNF-a生产能力的治疗方法相信具有显著的抗炎效果。发明人在许多方案中使用LPS刺激来产生炎症反应(參见实验方案1-3)，用于根据本发明的肽的抗炎效果的主要标记是抑制TNF-a生产的能力。
[0323]通过降低的/完全的动脉血供给阻止诱导的局部缺血诱导许多组织反应，包括嗜中性粒细胞累积、其他炎症反应和细胞死亡。鉴定能够抑制或预防(完全地或部分地)作为局部缺血的结果而发生的多数细胞/组织/器官损伤或破坏的化合物是非常有益的。发明人使用两个ー过性局部缺血模型:1)大鼠的心肌缺血再灌注模型，其模拟了后面是血供给恢复的急性心肌梗塞的发展，因为它是通过纤维蛋白溶解疗法或者冠状血管成形术获得的(实验方案4);2)双向肾动脉阻塞，其诱导急性肾衰竭(ARF)，其类似于在进行大外科介入治疗的患者中所见到的、由肾血液供给的瞬时减小诱导的ARF(由于腹主动脉瘤实施例能够进行手术介入治疗)(实验方案5)。
[0324]中毒性肾损害是顺钼治疗的公知的副作用。尽管限制肾毒性的剂量不一定仍然影响大多数患者，但是治疗过程中观察到肾小球浸润率的明显降低。顺钼的肾毒性可以看作对外髓层(尤其是近端小管的S3片段)和Henle环的升支粗段的肾单位直接的细胞毒素损伤。因此，顺钼治疗常常导致肾小管的重吸收缺陷，包括损坏的稀释尿的能力。在大约50%的以顺钼治疗过的患者中观察到低血镁症，其很可能是由于肾的镁(Mg)重吸收的缺陷。最近的研究表明补充Mg是保护免于环孢菌素A的肾毒性作用的重要因素，并且最近已指出了Mg损失和顺钼诱导的肾中毒之间的可能的关系。因此，g在防止低血镁症的治疗具有有益的效果，不仅为了降低补充Mg的需要而且为了降低顺钼的肾毒性。根据本发明的肽对于顺钼诱导的肾毒性在实验方案6中检验。
[0325]方法与材料
[0326]在下面描述的方法中本发明的肽是实验化合物。
[0327]实验方案I
[0328]抑制体外由人白细胞产生的LPS诱导的TNF-a的产生
[0329]在含有EDTA的真空血液收集管(vacutainer tube)中收集20mL人血。使用安玛西亚说明书(Amersham，s Instruction)71-7167-00AD, 2002-06 的菲科帕克 +(Ficoll-PaquePlus)来分离外周血单核细胞(PBMC)。使用台盼兰溶液(西格玛(Sigma))对PBMC计数，并且以5X IO5细胞/mL的浓度将PBMC温育在RPMI1640 (艾普力化学产品(Applichem))中，RPMI1640添加有IOmM轻乙基哌嗪こ磺酸(Hepes) (Sigma)、2mM L-谷氨酰胺(Sigma)、0.1%牛血清白蛋白(BSA) (Sigma)和50U/50 u g/mL青霉素/链霉素(Sigma)。在5%C02、95%空气的气氛中，在37°C下，将分离出来的PBMC温育在具有培养基、IOng LPS/mL (Sigma)和实验化合物的24孔平底板(康宁公司(Corning Incorporated))中。18小时后,将样品离心，使用来自人类百垂克(Human Biotrak)酶联免疫吸附测定(ELISA)系统(Amersham)的肿瘤坏死因子 a (Tumour Necrosis Factor Alpha) [ (h) TNF- a ]检测上清液的 TNF_a。
[0330] 每个供体采用如下的方式将样品温育:
[0331 ] PBMC 在 RPMI (时间对照)
[0332]PBMC 在 IOng LPS/mL (载体)
[0333]PBMC 在 IOng LPS/mL, KT17M a -MSH 或 a -MSH 类似物
[0334]PBMC 在 IOng LPS/mL, KT15M a -MSH 或 a -MSH 类似物
[0335]PBMC 在 IOng LPS/mL, KT13M a -MSH 或 a -MSH 类似物
[0336]PBMC 在 IOng LPS/mL, KT11M a -MSH 或 a -MSH 类似物
[0337]PBMC 在 IOng LPS/mL, KT9M a -MSH 或 a -MSH 类似物
[0338]PBMC 在 IOng LPS/mL, KT7M a -MSH 或 a -MSH 类似物
[0339]将所有的样品从初始储液稀释到1.4X 10_4M和1.8 X 10_3M之间。
[0340]将所有的溶液在BSA包被过的小瓶中处理以保护避免化合物键合到小瓶的表面上。
[0341]数据以平均数土SE表示。实验`化合物对LPS诱导的TNF-a释放的影响表示为LPS-载体组中TNF-a累积的百分数。用学生不成对t_检验分析所有的对比。在0.05的置信水平(P)下认为差异是显著的。
[0342]实验方案2
[0343]抑制大鼠体内的LPS诱导的TNF-a生产
[0344]实验动物:雌性Wistar 大鼠(220_240g)来自查理河(Charles River), Sulzfeld,德国，并使其居住在温度(22-24°C)以及湿度(40-70%)控制的、具有12小时明-暗循环(从6:00A.M.到6:00P.M.进行光照)的房间内。使大鼠保持标准的啮齿类饲料(具有140mmol/kg 钠、275mmol/kg 钾和 23% 蛋白质，阿尔托敏国际公司(Altromin International), Lage,德国)，并且具有接近水源的自由。
[0345]动物准备:在异氟烷-氧化亚氮麻醉的状态下，分别经由股动脉和静脉，将耐久的医用聚乙烯(Tygon)导管植入到腹主动脉和下腔静脉中。在植入之后，将动物単独圈养
7-10天直到实验日。
[0346]实验程序:在实验之前，通过训练所有大鼠两个周期(毎次两个小吋)，使它们适应用于实验的限制笼。在实验日，将动物转移到限制笼中，并且开始进行静脉注射含有150mM葡萄糖的载体溶液。整个实验过程中注射速率是0.5ml/h。在短暂的适应周期之后，开始注射脂多糖(LPS)。以4mg/kg体重的剂量给予LPS(大肠杆菌血清型0127B8，L3129, Sigma, St.Louis, USA)，静脉注射超过I小时进行输送。在LPS注射开始之后的60、90和120分钟取
0.3ml动脉血样品，并且立即用肝素化的来自正常供体大鼠的血替代。
[0347]实验组:
[0348]除了 LPS注射外所有大鼠用快速注射(bolus injection)处理:
[0349]载体(0.5mL等渗盐水)；
[0350]处于如下剂量之一的a-MSH:50 ii g/kg体重；200 ii g/kg体重或1000 ii g/kg体重；[0351]处于如下剂量之一的实验化合物:50 U g/kg体重；200 u g/kg体重或1000 U g/kg体重。[0352]血浆TNF- a的测定:在具有0.5mM EDTA, pH7.4，和20xl06IU/ml抑肽酶的预冷实验管中收集血液样品。经过4°C离心之后，将血浆样品转移到预冷实验管中并在-20°C贮藏用于后面的TNF-a測定。通过ELISA (Biotrak, Amersham,英国)测定血衆的TNF-a。
[0353]统计分析:结果以平均数土SE表示。使用用于重复测量的两因素方差分析(two-way AN0VA)检验组间差异。在p 0.05的情况下,通过具有置信水平的邦费罗尼(Bonferroni)校正的不成对t_检验,来评价相应期之间的差异。
[0354]实验方案3
[0355]抑制大鼠吸入LPS之后嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的浸润
[0356]使用来自M B A/S, DK_8680Ry，丹麦的雄性Sprague-Dawley大鼠用于所有实验。将大鼠关在3型标准笼中，使其居住在温度(22-24°C)以及湿度(40-70%)控制的、具有12小时明-暗循环(从6:00A.M.到6:00P.M.进行光照)的房间内。饲料是高压釜处理过的Altrominl324 特殊配方，该配方由 Altromin Denmark (Chr.Pedersen A/S, 4100Ringsted,丹麦)生产。无限制地给予饲料和水。
[0357]驯化之后将大鼠随机分派到实验组，在LPS诱导开始时静脉注射剂量给予实验化合物以及LPS诱导之后8小时再次静脉注射剂量给予实验化合物。
[0358]用0.1ml芬太尼/多美康/100g将组3的大鼠麻酔，并且静脉注射剂量给予实验化合物。在剂量给药之后立即将它们放置到呼吸室中，其中使它们喷雾LPS溶液。LPS的浓度为lmg/ml。剂量给药时间为15分钟。在以实验物质剂量给药之后24小时处死大鼠。最后用C02/02处死大鼠。
[0359]通过注入以及抽出6X2.5ml PBS到右肺中进行支气管肺泡灌洗。以在去掉胸骨和肋骨之后使肺仍然保持在胸中的状态进行灌洗。在该过程中将到左肺的连接管打结。在4°C、1000rpm下离心支气管肺泡灌洗液(BALF) 10分钟。去掉上清液后将细胞重悬浮在
0.5ml PBS中并进行总细胞计数。对来自姆一个大鼠的、用姬姆萨(May-Griiwald Giemsa)染料染色过的BALF，制备两个涂片。对来自每ー个大鼠的BALF进行总细胞计数和白细胞分类计数。
[0360]实验组:
[0361 ] 载体(0.5mL等渗盐水)；
[0362]a -MSH:200 U g/kg 体重；
[0363]a -MSH 类似物:200 U g/kg 体重。
[0364]最后用载体处理没有吸入LPS的时间对照组。
[0365]统计:
[0366]数据以平均数土SE表示。通过后面是费舍最小显著性差异法的单因素变量分析进行组间对比。在0.05水平认为差异是显著的。
[0367]实验方案4
[0368]抑制猪体内的LPS诱导的细胞因子的释放和肺高血压
[0369]将雌性长白猪(Landrace pig)(~30kg)禁食过夜但允许自由接近水源。然后肌肉注射氯胺酮(10mg/kg)和咪唑达仑(0.25mg/kg)对猪进行术前用药。静脉注射氯胺酮(5mg/kg)引起麻酔。将猪从口腔插入管子，并且用连续的静脉注射芬太尼(eoyg/kg/h)和咪唑达仑(6mg/kg/h)来保持麻酔。以5cm H2O的呼气末正压用体积控制的通风管(Servo900通风机(ventilator);西门子(Siemens) Elema, Solna,瑞典)对动物通气。呼吸容量保持在10-15ml/kg,并且调整呼吸速率(20-25次/min)以保持血碳酸不变(动脉二氧化碳[PaCO2]在34-45mmHg)。用混合空气的氧气进行通气_在使动脉氧压カ(PaO2)高于105mmHg。将一个动脉鞘和两个静脉鞘设置在颈动脉和相应静脉中，所述静脉用于灌注、通过充满流体的导管测量血压、取血、和用于引入导管。
[0370]经由右上腔静脉在肺动脉中插入肺动脉漂浮导管(Swan-Ganz)(爱德华生物公司(Edwards Lifescience Corp.) , Irvine,カロ利福尼亚州)。因为它是通过心脏的右侧进入到肺动脉中的，可以通过观察监测器上的特征压力曲线以及通过X-射线来确定气囊导管的位置。在左颈动脉插入另一导管(5French;St.Jude Medical Company, St.Paul,明尼苏达州)用于连续血压监测以及血液取样。插入尿导管用于收集尿。当评估心脏表现时，将临时起博导管通过静脉鞘插入到右心房(X-射线指导)用来使心率标准化。
[0371]血液动力学监测:进行连续观测动脉血压、心率(从心电图)以及肺动脉压力(PAP)0
[0372]脂多糖注入:在每ー实验之前120min将大肠杆菌脂多糖内毒素(E.coli026:_6, Bacto脂多糖;迪夫可实验室(Difco Laboratories), Detroit,密歇根州)溶解在盐水中以溶解任何沉淀物。经过一段稳定时间后，在基线为2.g/kg/h的速度并且在30分钟内逐步增加到15y g/kg/h的条件下开始注射脂多糖。之后，在150分钟内将注射速度保持在2.5 u g/kg/h，此后停止注射。
[0373]介入组:在LPS注射开始前立即给予对照组与介入组相等体积的载体。将a -MSH类似物(剂量为200 y g/kg)作为单静脉快速注射给予到介入组。
[0374]细胞因子:通过根据产品说明书使用商品酶联免疫分析，使用从EDTA稳定了的血获得的新鲜冷冻血浆样品来測量 TNF-a，
[0375]统计:数据以平均数土SE表示。通过后面是费舍最小显著性差异法的单因素变量分析进行组间对比。在0.05水平认为差异是显著的。
[0376]实验方案5
[0377]抑制通过阻塞大鼠左前降支冠状动脉60min诱导的心肌梗塞面积
[0378]隔离喂养的以及无特定病原体的雌性Wistar大鼠(250g)来自CharlesRiver, Hannover,德国。使动物居住在温度(22_24°C )以及湿度(40-70%)控制的、具有12小时明-暗循环(从6:00A.M.到6:00P.M.进行光照)的房间内。所有动物允许自由接触自来水和丸状大鼠饲料，其大约含有140mmol/kg钠、275mmol/kg钾和23%蛋白(Altromincatalogue n0.1310, Altromin International, Lage,德国)。
[0379]经由股动脉和静脉，将耐久的医用Tygon导管植入到下腔静脉和腹主动脉中。一周后在呼吸腔内用含有4%异氟烷的O2使大鼠麻酔。在插入气管导管之后，使用如下HugoBasile Rodent通气机用含有1.0%异氟烷的O2对动物进行人工通气。呼吸容量是8_10ml/kg体重，呼吸速率是保持动脉pH在7.35-7.45之间。手术过程中，将动物放置在可保持直肠温度在37-38°C的加热的手术台上。使用Hugo Sachs ECG仪测量标准ECG (第二导线)，并且在PowerLab上在4，OOOHz的线上收集标准ECG。在胸骨旁切开以及打开心包膜之后，目视固定左前降支冠状动脉(LAD)。围绕LAD四周在肺动脉干和左耳廓的右下端之间设置具有允许缝线再开ロ的咬合器的无害6-0丝线。10分钟后，使左前降支冠状动脉(LAD)咬合。通过ECG的变化(ST-片段上升并且R-波放大增加)以及MAP的下降来确认咬合成功。60分钟后通过打开咬合器进行再灌注。对照大鼠进行假手木。
[0380]将大鼠进行以下静脉注射处理的ー种:
[0381]载体:0.5mll50mM NaCl。
[0382]a -MSH:溶于 0.5mll50mM NaCl 的 200 ii g 或 1000 Uga-促黑素 /kg 体重。
[0383]实验化合物:溶于0.5mll50mM NaCl的200 ii g或1000 U g实验化合物/kg体重。
[0384]在再灌注之前5分钟给予上述处理。
[0385]如下确定局部缺血以及坏死的心肌的大小
[0386]在局部缺血/再灌注之后使大鼠保持在麻醉状态，在三小时再灌注后进行LAD的重咬合。在这个时期，连续测量ECG和MAP。然后静脉注射伊文思蓝染料用来确定局部缺血面积的大小。将心脏切除并将其切成水平分层用来确定局部缺血面积的大小和将缺血的心肌从坏死的心肌中分开出来。将局部缺血的面积分离，将其在37°C下在0.5%2，3，5-三苯基氯化四氮唑溶液中温育10分钟。然后使用计算机成像程序测定坏死的组织的大小。为了评价对充血性心脏衰竭的医学治疗效果，将另一方案的动物术后用丁丙诺啡处理，然后返回到笼子中用于两周后測量左室舒张末压(LVEDP)。使用经由右颈动脉插入到左心室的2F微顶导管测量LVEDP。调节异氟烷浓度使平均动脉压力(MAP)稳定在85-90mmHg。
[0387]统计:`
[0388]数据以平均数土SE表示。用学生成对t检验分析组内对比。通过后面是费舍最小显著性差异法的单因素变量分析进行组间对比。在0.05水平认为差异是显著的。
[0389]实验方案6
[0390]抑制通过双向堵塞大鼠肾动脉40分钟诱导的肾衰竭
[0391]隔离喂养以及无特定病原体的雌性Wistar大鼠(250g)来自CharlesRiver, Hannover,德国。使动物居住在温度(22_24°C )以及湿度(40-70%)控制的、具有12小时明-暗循环(从6:00A.M.到6:00P.M.进行光照)的房间内。所有动物允许自由接触自来水和丸状大鼠饲料，其大约含有140mmol/kg钠、275mmol/kg钾和23%蛋白(Altromincatalogue n0.1310, Altromin International, Lage,德国)。
[0392]将预先植入有长期肾导管的大鼠放置于代谢笼中，经过代谢笼的两天适应期之后，通过堵塞肾动脉的两端60min诱导实验性ARF。在手术过程中，用异氟烷-一氧化氮麻醉大鼠，将其放置在加热的手术台上以保持直肠温度在37°C。通过肋腹切开使两个肾暴露，通过将其从肾周围脂肪上切除使其松动，然后从静脉上轻轻地切下一小部分肾动脉。用表面光滑的血管夹(60g压カ；World Precision Instruments,英国)堵塞肾动脉40min。通过观察整个肾表面的变白现象确认完全局部缺血。在局部缺血期间，暂时縫合伤ロ以保持体温。在去掉夹子之后，再观察肾2-5min以确保指示血回流的颜色变化。然后用3-0丝线缝合伤ロ。将大鼠放回代谢笼中，每天測定24h的尿排出量和水摄取量，共5天。作为对照组，大鼠进行与用于ARF相同的假手术而不堵塞肾动脉。平行监测假手术的大鼠与具有ARF的大鼠。
[0393]使大鼠进行如下静脉注射处理的ー种:[0394]载体组:0.5mll50mM NaCl。
[0395]a -MSH 组:溶于 0.5mll50mM NaCl 的 200 ii g a -促黑素 /kg 体重。
[0396]实验化合物组:溶于0.5mll50mM NaCl的200 U g实验化合物/kg体重。在肾的再灌注之前的5分钟，接着在6小时和24小时后给予上述处理。
[0397]统计:
[0398]数据以平均数土SE表示。用学生成对t检验分析组内对比。通过后面是费舍最小显著性差异法的单因素变量分析进行组间对比。在0.05水平认为差异是显著的。
[0399]实验方案7
[0400]抑制顺钼诱导的肾衰竭
[0401]将预先植入有长期肾导管的大鼠放置于代谢笼中，经过对代谢笼的适应期之后，用腹腔注射溶于0.5mll50mM NaCI的顺钼5.0mg/kg体重或载体(0.5mll50mM NaCI)来处理大鼠。然后，5天后将大鼠放回代谢笼，每天測定并收集接下来5天内24h尿排出量和水摄取量。然后在氟烷/N2O中将所有的大鼠麻酔，在预冷的EDTA包被的小瓶中收集动脉血样品。将血液样品收集在含有0.5mM EDTA, pH7.4,以及20xl06IU/ml抑肽酶的预冷实验管中。经过4°C离心后，将血浆样品转移到预冷实验管，并且保存在-20°C用于以后測定肌酸酐和镁(Mg)。除此之外，还测定在血液收集之前的最近24小时期间收集的尿中的肌酸酐。用作肾小球浸润率指数的肌酸酐清除率(Cra)可以计算如下:Cra=Vu X U。ノPra，这里Vu是24小时尿产量；Ura是尿中肌酸酐浓度，Pra是血浆中肌酸酐浓度。使用临床化学系统VITE0S950(校正临床诊断公司(Ortho-Cl inical Diagnostics Inc.) , Johnson Johnson,新泽西州)以及罗氏日立模块(Roche Hitachi Modular)(罗氏诊断(Roche Diagnostics),曼海姆(Mannheim),德国)进行尿和血衆中肌酸酐的測定。
[0402]使大鼠进行如下静脉注射处理的ー种:
[0403]载体组:0.5mll50mM NaCl。
[0404]a -MSH 组:溶于 0.5mll50mM NaCl 的 200 ii g a -促黑素 /kg 体重。
[0405]实验化合物组:溶于0.5mll50mM NaCl的200 U g实验化合物/kg体重。在肾的再灌注之前的5分钟，接着在6h和24h后给予上述处理。
[0406]统计:
[0407]数据以平均数土SE表示。用学生成对t检验分析组内对比。通过后面是费舍最小显著性差异法的单因素变量分析进行组间对比。在0.05水平认为差异是显著的。
[0408]结果
[0409]实施例1
[0410]实验化合物是a -MSH类似物#1:
[0411]Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列I*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)
[0412]将该化合物在实验方案1-7进行实验。
[0413]抑制体外由人白细胞产生的LPS诱导的TNF-a的产生
[0414]a -MSH和a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)两者都剂量依赖地降低人白细胞悬液中LPS诱导的TNF-a累积。令人意外的是，a-MSH类似物#I (序列表序列I*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更显著。a-MSH抑制TNF-a累积到最大反应(LPS-载体)的73±9%。与此相反，a-MSH类似物#I (序列表序列I*)能降低TNF-a累积到载体的 47±2% (对 a-MSH 组 p〈0.01)(见图1)
[0415]抑制大鼠体内的LPS诱导的TNF-a生产
[0416]在静脉注射LPS的过程中，a -MSH和a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)两者都降低了大鼠中TNF-a累积。在200 ii g/kg体重的剂量下获得了 a-MSH以及a-MSH类似物#1 (序列表序列I*)的最大抑制效果，并且在LPS注射开始之后120分钟显示出对TNF- a生产的最大抑制效果。令人意外的是，a-MSH类似物#I (序列表序列I*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更显著。尽管a-MSH抑制大鼠血浆中的TNF-a浓度到最大反应(LPS-载体)的17±3%，但是a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)能降低TNF-a累积到载体的 9±1% (对 a-MSH 组 p = 0.05)(见图 2)。
[0417]抑制大鼠吸入LPS之后嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的浸润
[0418]如LPS吸入之后24小时收集的BALF中嗜酸性粒细胞的显著降低所显示的那样，a -MSH和a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)两者都降低在肺泡腔内的对LPS吸入的炎症反应。与BALF内的嗜酸性粒细胞的数量是164.6±42.2X 105个细胞的、载体处理的大鼠相比，a-MSH处理减小BALF内的嗜酸性粒细胞的数量到26.7±4.3X IO5个细胞(对载体组，p〈0.05)，a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)减小BALF内的嗜酸性粒细胞的数量到49.0±10.5X105个细胞(对载体组，p〈0.05)(见图3)。与上相同，对于a-MSH和a-MSH类似物#1 (序列表序列I*)来说，BALF内的嗜中性粒细胞的数量的效果是相似的。
[0419]抑制猪体内LPS诱导的细胞因子的释放和肺高血压
[0420]如在用a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)处理的猪中在LPS注射之后显著降低的TNF-a的血浆浓度所显示的那样，a-MSH类似物#I (序列表序列I*)具有显著的抗炎效果。除了这种抗炎效果之外，令 人意外的是，a-MSH类似物#I (序列表序列I*)还具有保护避免肺高血压发展的能力，这可以通过在用a-MSH类似物#I (序列表序列I*)处理的大鼠中发现的、显著减弱LPS诱导的PAP增幅来证实(最大PAP增幅:载体组:22±4mmHg，a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)组:8±2mmHg ；p = 0.05)(见图4)。
[0421]抑制通过阻塞大鼠左前降支冠状动脉60min诱导的心肌梗塞面积
[0422]与a -MSH相反，令人意外的是，a -MSH类似物#1(序列表序列I*)降低了心肌梗塞面积，心肌梗塞面积以坏死面积/梗死危险面积表示，并且在LAD再灌注之后3小时測定。在200 u g/kg体重的剂量下获得了 a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)的最大抑制效果，其中与载体处理的大鼠相比，梗塞面积的降低是~30% (载体组:危险面积的50.6±2.6%，a -MSH类似物#1(序列表序列I*)组:危险面积的35.7±5.6% ；p = 0.01)。在1000 u g/kg体重的剂量下，与载体处理的大鼠相比，梗塞面积的降低还是~30% ( a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)组:危险面积的35.0±4.4%，对载体组p〈0.01)(见图5)。在堵塞LAD60分钟之后14天测量另一方案动物的左室舒张末压(LVEDP)，结果显示a -MSH类似物#1(序列表序列I*)对梗塞面积的有益效果伴随有LVEDP以及梗死后充血型心脏衰竭发展的显著降低(LVEDP: a -MSH 类似物 #1 (序列表序列 I*)组:10.4±2.9mmHg ;对载体组:20.2±2.2mmHg ；p 0.01 ;对时间对照:7.5±2.3mmHg ;无显著性)(见图6)。
[0423]抑制通过双向堵塞大鼠肾动脉40分钟诱导的肾衰竭
[0424]60分钟双向肾局部缺血(RIR)诱导明显的缺血后多尿症。RIR大鼠具有相同的多尿症，与假手术的对照大鼠相比，在局部缺血损害之后的第5天多尿量増加101%(RIR-载体组:34.8±3.3ml/24 小时，时间对照:17.3±2.lml/24 小时，p〈0.01)。a -MSH 处理不能减轻多尿症(RIR-a-MSH组:29.0±2.9ml/24小时；对RIR-载体无显著性)。令人意外的是，a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)能够诱导尿流量的完全正常化(RIR- a -MSH类似物#1(序列表序列I*)组:18.8±3.6ml/24小时；对时间对照无显著性；对RIR-载体组p〈0.01)(见图7)。
[0425]抑制顺钼诱导的肾衰竭
[0426]如GFR下降所证实的那样，顺钼处理诱导明显的低血镁症和肾中毒。根据这一点，用顺钼和载体处理大鼠诱导出低血镁症(血浆Mg:0.61 土 0.04mM,对照大鼠:0.77±0.05mM，p〈0.05)以及明显的GFR下降。在用顺钼和a-MSH处理过的大鼠中血浆Mg同样降低(0.37 + 0.04mM，对对照大鼠p〈0.05)。令人意外的是，用a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)处理防止了顺钼诱导的低血镁症(0.84±0.04禮，相对于对照大鼠无显著性)以及防止了顺钼诱导的GFR下降。
[0427]实施例2
[0428]实验化合物是a -MSH类似物#2:
[0429]Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-GlY-Lys-Pro-Val-NH2 (序列表序列5*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)
[0430]通过在位点10用Nle取代Met以及通过在位点13用(D-Phe)立体化学取代Phe，使a -MSH类似物#2 (序列表序列5)区别于a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)。
[0431]在实验方案1-3和5-7中试验该化合物。
[0432]抑制体外人白细胞产生的LPS诱导的TNF-a生产
[0433]a -MSH和a -MSH类似物#2 (序列表序列5*)两者都剂量依赖地降低人白细胞悬液中LPS诱导的TNF-a累积。令人意外的是，a-MSH类似物#2 (序列表序列5*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更显著。a-MSH抑制TNF-a累积到最大反应(LPS-载体)的73±9%。与此相反，a-MSH类似物#2 (序列表序列5*)能降低TNF-a累积到载体的 42±11% (对 a-MSH 组 p〈0.01)(见图 8)。
[0434]抑制大鼠体内LPS诱导的TNF- a生产
[0435]在静脉注射LPS的过程中，a -MSH和a -MSH类似物#2 (序列表序列5*)两者都降低了大鼠的TNF-a累积。在200 ii g/kg体重的剂量下获得了 a-MSH以及a-MSH类似物#2 (序列表序列5*)的最大抑制效果。令人意外的是，a-MSH类似物#2 (序列表序列5*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更显著。尽管a-MSH抑制大鼠血浆中的TNF-a浓度到最大反应(LPS-载体)的17±3%，但是a-MSH类似物#2 (序列表序列5*)能降低TNF- a累积到载体的9± 1% (对a -MSH组p〈0.05)(见图9)。
[0436]抑制大鼠吸入LPS之后嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的浸润
[0437]如LPS吸入之后24小时收集的BALF中嗜酸性粒细胞的显著降低所显示的那样，a -MSH和a -MSH类似物#2 (序列表序列5*)两者都降低肺泡腔内的对LPS吸入的炎症反应。与BALF内的嗜酸性粒细胞的数量是164.6±42.2X 105个细胞的、载体处理的大鼠相比，a -MSH处理减小BALF内的嗜酸性粒细胞的数量到26.7±4.3 X IO5个细胞(对载体组，p〈0.05)，a -MSH类似物#2 (序列表序列5*)减小BALF内的嗜酸性粒细胞的数量到34.0±8.6X105个细胞(对载体组，p〈0.05)(见图10)。令人意外的是，a-MSH类似物#2(序列表序列5*)具有比a -MSH更明显的对BALF内的嗜中性粒细胞的抑制效果(a -MSH类似物#2 (序列表序列5*)组:9.1±2.4X105个细胞，a-MSH组:20.1 ±2.5 X IO5个细胞;p〈0.05)(见图 11)。
[0438]抑制通过阻塞大鼠左前降支冠状动脉60分钟诱导的心肌梗塞面积
[0439]与a -MSH相反，令人意外的是，a -MSH类似物#2 (序列表序列5*)降低了心肌梗塞面积，心肌梗塞面积以坏死面积/梗死危险面积表示，并且在LAD再灌注之后3小时測定。在200 ii g/kg体重的剂量下获得了 a-MSH类似物#2 (序列表序列5*)的最大抑制效果，其中与载体处理的大鼠相比，梗塞面积的降低是~27% (载体组:危险面积的51.4±2.1%, a -MSH类似物#2 (序列表序列5*)组:危险面积的37.4±5.1% ；p = 0.01)(见图12)。在堵塞LAD60分钟之后14天测量另一方案动物的左室舒张末压(LVEDP)，结果显示a -MSH类似物#2 (序列表序列5*)对梗塞面积的有益效果伴随有LVEDP以及梗死后充血型心脏衰竭发展的显著降低。
[0440]抑制通过双向堵塞大鼠肾动脉40分钟诱导的肾衰竭
[0441]60分钟双向肾局部缺血(RIR)诱导明显的缺血后多尿症。RIR大鼠具有相同的多尿症，与假手术的对照大鼠相比，在局部缺血损害之后的第5天多尿量増加101% (RIR-载体组:34.8±3.3ml/24 小时，时间对照:17.3±2.lml/24 小时，p〈0.01)。a -MSH 处理不能减轻多尿症(RIR-a-MSH组:29.0±2.9ml/24小时；对RIR-载体组无显著性)。与此相反，用a-MSH类似物#2 (序列表序列5*)处理显著降低了在RIR之后发现的多尿症程度。
[0442]抑制顺钼诱导的肾衰竭
[0443]如GFR下降所证实的那样，顺钼处理`诱导明显的低血镁症和肾中毒。根据这一点，用顺钼和载体处理大鼠诱导出低血镁症(血浆Mg:0.61 土 0.04mM,对照大鼠:0.77±0.05mM，p〈0.05)以及明显的GFR下降。在用顺钼和a-MSH处理过的大鼠中血浆Mg同样降低(0.37±0.04mM，对对照大鼠p〈0.05)。与此相反，a -MSH类似物#2 (序列表序列5*)防止了顺钼诱导的低血镁症以及顺钼诱导的GFR下降。
[0444]实施例3
[0445]实验化合物是a -MSH类似物#3:
[0446]Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-NH2 (序列表序列9*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)
[0447]通过在位点10用Nle取代Met以及通过在位点13用D-Nal取代Phe，使a -MSH类似物#3 (序列表序列9)区别于a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)。
[0448]在实验方案1、2和5中试验该化合物。
[0449]抑制体外LPS诱导的TNF-a产生，其中TNF-a由人白细胞产生。
[0450]a -MSH和a -MSH类似物#3 (序列表序列9*)两者都剂量依赖地降低人白细胞悬液中LPS诱导的TNF-a累积。令人意外的是，a-MSH类似物#3 (序列表序列9*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更显著。a-MSH抑制TNF-a累积到最大反应(LPS-载体)的73±9%。与此相反，a-MSH类似物#3 (序列表序列9*)能降低TNF-a累积到载体的 53 ±13% (对 a-MSH 组 p〈0.05)(见图 13)。
[0451 ] 抑制大鼠体内LPS诱导的TNF- a生产[0452]在静脉注射LPS的过程中，a -MSH和a -MSH类似物#3 (序列表序列9*)两者都降低了大鼠的TNF-a累积。在200 ii g/kg体重的剂量下获得了 a-MSH以及a-MSH类似物#3 (序列表序列9*)的最大抑制效果。令人意外的是，a-MSH类似物#3 (序列表序列9*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更显著。尽管a-MSH抑制大鼠血浆中的TNF-a浓度到最大反应(LPS-载体)的17±3%，但是a -MSH类似物#3 (序列表序列9*)能降低TNF-a 累积到载体的 11±3% (对 a-MSI^ip〈0.05)(见图 14)。
[0453]抑制通过阻塞大鼠左前降支冠状动脉60min诱导的心肌梗塞面积
[0454]与a -MSH相反，令人意外的是，a -MSH类似物#3 (序列表序列9*)降低了心肌梗塞面积，心肌梗塞面积以坏死面积/梗死危险面积表示，并且在LAD再灌注之后3小时測定。在200 ii g/kg体重的剂量下获得了 a-MSH类似物#2 (序列表序列5*)的最大抑制效果，其中与载体处理的大鼠相比，梗塞面积的降低是~24% (载体组:危险面积的51.3±2.1%, a -MSH类似物#3 (序列表序列9*)组:危险面积的39.0±3.4% ；p = 0.05)(见图15)。在堵塞LAD60分钟之后14天测量另一方案动物的左室舒张末压(LVEDP)，结果显示a -MSH类似物#3 (序列表序列9*)对梗塞面积的有益效果伴随有LVEDP以及梗死后充血型心脏衰竭发展的显著降低。
[0455]实施例4
[0456]实验化合物是a -MSH类似物#4:
[0457]Ac_Lys_Lys_Lys_しys_Lys_Lys_ber_Ser_Ile_Iie_Ser_His_Phe_Arg_Trp_(aly_LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列13*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)
[0458]通过在位点8用Ser取代Tyr，在位点9用Ile取代Ser，在位点10用Ile取代Met以及通过在位点11用Ser取代Glu，使a -MSH类似物#4 (序列表序列13)区别于a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)。
[0459]在实验方案I和2中试验该化合物。
[0460]抑制体外由人白细胞产生的LPS诱导的TNF-a的产生
[0461]a -MSH和a -MSH类似物#4 (序列表序列13*)两者都剂量依赖地降低人白细胞悬液中LPS诱导的TNF- a累积。令人意外的是，a -MSH类似物#4 (序列表序列13*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更显著。
[0462]抑制大鼠体内LPS诱导的TNF- a生产
[0463]在静脉注射LPS的过程中，a -MSH和a -MSH类似物#4 (序列表序列13*)两者都降低了大鼠的TNF-a累积。在200 ii g/kg体重的剂量下获得了 a-MSH以及a-MSH类似物#4 (序列表序列13*)的最大抑制效果。令人意外的是，a-MSH类似物#4 (序列表序列13*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更显著。尽管a-MSH抑制大鼠血浆中的TNF-a浓度到最大反应(LPS-载体)的17±3%，但是a-MSH类似物#4 (序列表序列13*)能降低TNF-a累积到载体的12±2% (对a-MSH组p〈0.05)(见图16)。
[0464]实施例5
[0465]实验化合物是a -MSH类似物#5:
[0466]Ac_Lys_Lys_Lys_しys—Lys—Lys—ber—Ser—Ile—Iie—Ser—His—(D-Phe)—Arg—Trp—G丄Y-Lys-Pro-Val-NH2 (序列表序列17*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)
[0467]通过在位点8用Ser取代Tyr，在位点9用Ile取代Ser，在位点10用Ile取代Met，通过在位点11用Ser取代Glu以及通过在位点13用(D-Phe)立体化学取代Phe，使a -MSH类似物#5 (序列表序列17)区别于a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)。
[0468]在实验方案I和2中试验该化合物。
[0469]抑制体外由人白细胞产生的LPS诱导的TNF-a的产生
[0470]a -MSH和a -MSH类似物#5 (序列表序列17*)两者都剂量依赖地降低人白细胞悬液中LPS诱导的TNF- a累积。令人意外的是，a -MSH类似物#5 (序列表序列17*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更显著。
[0471 ] 抑制大鼠体内LPS诱导的TNF- a生产
[0472]在静脉注射LPS的过程中，a -MSH和a -MSH类似物#5 (序列表序列17*)两者都降低了大鼠的TNF-a累积。在200 ii g/kg体重的剂量下获得了 a-MSH以及a-MSH类似物#5 (序列表序列17*)的最大抑制效果。令人意外的是，a-MSH类似物#5 (序列表序列17*)的抑制效果比天然肽a -MSH的抗炎效果更显著。
[0473]实施例6
[0474]实验化合物是a -MSH类似物#6:
[0475]Ac-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Glu-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-LyS-Pro-Val-NH2 (序列表序列2*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)
[0476]通过在位点1-6用(Glu) 6取代(Lys) 6，使a -MSH类似物#6 (序列表序列2)区别于a-MSH类似物#I (序列表序列 I *)。
[0477]在实验方案I和2中实验该化合物。
[0478]抑制体外由人白细胞产生的LPS诱导的TNF-a的产生
[0479]a -MSH和a -MSH类似物#6 (序列表序列2*)两者都剂量依赖地降低人白细胞悬液中LPS诱导的TNF-a累积。令人意外的是，a-MSH类似物#6 (序列表序列2*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更显著。
[0480]抑制大鼠体内LPS诱导的TNF- a生产
[0481 ] 在静脉注射LPS的过程中，a -MSH和a -MSH类似物#6 (序列表序列2*)两者都降低了大鼠的TNF-a累积。在200 ii g/kg体重的剂量下获得了 a-MSH以及a-MSH类似物#6 (序列表序列2*)的最大抑制效果。令人意外的是，a-MSH类似物#6 (序列表序列2*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更显著。
[0482]实施例7
[0483]实验化合物是a -MSH类似物#7:
[0484]Ac-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro- (D-Val) -NH2 (序列表序列3*在N-端被こ酰化并且在C-端被酰胺化)
[0485]通过在位点19用(D-Val)化学立体取代Val，使a -MSH类似物#7 (序列表序列3)区别于a -MSH类似物#1 (序列表序列I*)。
[0486]在实验方案I和2中实验该化合物。
[0487]抑制体外由人白细胞产生的LPS诱导的TNF-a的产生
[0488]a -MSH和a -MSH类似物#7 (序列表序列3*)两者都剂量依赖地降低人白细胞悬液中LPS诱导的TNF-a累积。令人意外的是，a-MSH类似物#7 (序列表序列3*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更显著。[0489]抑制大鼠体内LPS诱导的TNF- a生产
[0490]在静脉注射LPS的过程中，a -MSH和a -MSH类似物#7 (序列表序列3*)两者都降低了大鼠的TNF-a累积。在200 ii g/kg体重的剂量下获得了 a-MSH以及a-MSH类似物#7 (序列表序列3*)的最大抑制效果。令人意外的是，a-MSH类似物#7 (序列表序列3*)的抑制效果比天然肽a-MSH的抗炎效果更显著。
【专利附图】
【附图说明】
[0491]图1人白细胞悬液中LPS诱导的TNF- a累积
[0492]该图显示了在实验方案I中a -MSH类似物#1 (序列表序列I*) (MCA#I)的最大抗炎效果。对于。-|^11和1?^#1在10_%情况下获得对1^3诱导的1即-0生产的最大抑制效果。平均值土SE (每组中N = 6-9)。*:对载体组p〈0.05，#:对a -MSH组p〈0.05。
[0493]图2血浆中LPS诱导的TNF- a累积
[0494]该图显示了在实验方案2中a -MSH类似物#1 (序列表序列I*) (MCA#I)的最大抗炎效果。对于a -MSH和MCA#1在静脉注射200 u g/kg体重情况下获得对大鼠LPS诱导的TNF-a生产的最大抑制效果。平均数土SE (每组中N = 4_6)。*:对载体组p〈0.05，#:对 a -MSH 组 p〈0.05。
[0495]图3嗜酸性粒细胞
[0496]该图显示了在实验方案3中a -MSH和a -MSH类似物#1(序列表序列1*)(MCA#1)对肺泡内嗜酸性粒细胞累积的作用。两个化合物在200 u g/kg体重的剂量下静脉推注给药。平均数土SE (每组中N = 6-9)。与载体不同。
[0497]图4肺动脉压
[0498]该图显示了 a-MSH类似物#I (序列表序列I*) (MCA#1)对LPS诱导的猪肺动脉压变化的作用。平均数土SE (每组中N = 6-9)。*:与载体不同。
[0499]图5再灌注之后3小时的梗塞面积
[0500]该图显示了在实验方案4中a -MSH类似物#1 (序列表序列I*) (MCA#1)对心肌梗塞面积的保护作用。通过静脉注射给予200 y g/kg体重获得MCA#1的最大效果。平均数土SE (姆组中N = 5-10)。*:与载体不同。
[0501 ] 图6在60min LAD堵塞之后两周的LVEDP
[0502]该图显示了在实验方案4中a -MSH类似物#1 (序列表序列I*) (MCA#1)对梗死后充血性心カ衰竭的保护作用。通过200 u g/kg体重获得MCA#1的效果。平均数土SE(每组中N = 6-9)。*:对假手术 组p〈0.05，#:对载体组p〈0.05。
[0503]图1多尿量
[0504]该图显示了在实验方案5中a -MSH类似物#1 (序列表序列I*) (MCA#1)对缺血后多尿症发展的保护作用。通过静脉注射给予200 y g/kg体重获得MCA#1的效果。平均数土SE (每组中N = 5-7)。与载体不同。
[0505]图8人白细胞悬液中LPS诱导的TNF- a累积
[0506]该图显示了在实验方案I中a -MSH类似物#2 (序列表序列5*) (MCA#2)的最大抗炎效果。对于a -MSH和MCA#2在10_7M情况下获得对LPS诱导的TNF- a生产的最大抑制效果。平均数土SE (每组中N = 6-9)。*:对载体组p〈0.05，#:对a -MSH组p〈0.05。[0507]图9血浆中LPS诱导的TNF-a累积
[0508]该图显示了在实验方案2中a -MSH类似物#2 (序列表序列5*) (MCA#2)的最大抗炎效果。对于a-MSH和MCA#2在静脉注射200 ii g/kg体重情况下获得对大鼠LPS诱导的TNF-a生产的最大抑制效果。平均数土SE (每组中N = 4_6)。*:对载体组p〈0.05，#:对 a -MSH 组 p〈0.05。
[0509]图10嗜酸性粒细胞
[0510]该图显示了在实验方案3中a -MSH和a -MSH类似物#2(序列表序列5*)(MCA#2)对肺泡内嗜酸性粒细胞累积的作用。两个化合物在200 u g/kg体重的剂量下静脉推注给药。平均数土SE (每组中N = 6-9)。与载体不同。
[0511]图11嗜中性粒细胞
[0512]该图显示了在实验方案3中a -MSH和a -MSH类似物#2(序列表序列5*)(MCA#2)对肺泡内嗜中性粒细胞累积的作用。两个化合物在200 u g/kg体重的剂量下静脉推注给药。平均数土SE (每组中N = 6-9)。与载体不同。
[0513]图12再灌注之后3小时的梗塞面积
[0514]该图显示了在实验方案4中a -MSH类似物#2 (序列表序列5*) (MCA#2)对心肌梗塞面积的保护作用。通过静脉注射给予200 y g/kg体重获得MCA#1的最大效果。平均数土SE (姆组中N = 5-10)。*:与载体不同。
[0515]图13人白细胞悬液中LPS诱导的TNF-a累积
[0516]该图显示了在实验方案I中a -MSH类似物#3 (序列表序列9*) (MCA#3)的最大抗炎效果。对于a -MSH和MCA#3在1`0_7M情况下获得对LPS诱导的TNF- a生产的最大抑制效果。平均数土SE (每组中N = 6-9)。*:对载体组p〈0.05，#:对a -MSH组p〈0.05。
[0517]图14血浆中LPS诱导的TNF- a累积
[0518]该图显示了在实验方案2中a -MSH类似物#3 (序列表序列9*) (MCA#3)的最大抗炎效果。对于a-MSH和MCA#3在静脉注射200 ii g/kg体重情况下获得对大鼠LPS诱导的TNF-a生产的最大抑制效果。平均数土SE (每组中N = 4_6)。*:对载体组p〈0.05，#:对 a -MSH 组 p〈0.05。
[0519]图15再灌注之后3小时的梗塞面积
[0520]该图显示了在实验方案4中a -MSH类似物#3 (序列表序列9*) (MCA#3)对心肌梗塞面积的保护作用。通过静脉注射给予200 y g/kg体重获得MCA#3的最大效果。平均数土SE (姆组中N = 5-10)。*:与载体不同。
[0521]图16血浆中LPS诱导的TNF- a累积
[0522]该图显示了在实验方案2中a -MSH类似物#4 (序列表序列13*) (MCA#4)的最大抗炎效果。对于a -MSH和MCA#4在静脉注射200 u g/kg体重情况下获得对大鼠LPS诱导的TNF-a生产的最大抑制效果。平均数土SE (每组中N = 4_6)。*:对载体组p〈0.05，#:对 a -MSH 组 p〈0.05。
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【权利要求】
1.肽的制备方法，所述肽的长度为19个氨基酸残基且包括如下氨基酸序列: Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列1)， 其中，所述肽的氨基端是CH3-C (=0)-，所述肽的羧基端是-C (=0) -NH2, 所述肽通过溶液合成法、Merrifield型固相合成法或重组DNA技术来制备。
2.肽的制备方法，所述肽的长度为19个氨基酸残基且包括如下氨基酸序列: Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列5)，和
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-D-Nal-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列9)， 其中所述肽的氨基端是CH3-C (=0)以及 其中所述妝的羧基端是-C (=0)-NH2 ； 其中所述肽具有激活选自1、3、4和5型黑皮质素受体的一种或多种黑皮质素受体的能力， 所述肽通过溶液合成法、Merrifield型固相合成法或重组DNA技术来制备。
3.根据权利要求2所述的方 法，其中，所述肽包括如下序列:
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Phe)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列5)。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述肽包括如下序列:
Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Lys-Ser-Tyr-Ser-Nle-Glu-His-(D-Nal)-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val (序列表序列9)。
5.根据权利要求1-4中任何一项所述的方法,其中,所述肽通过Merrifield型固相合成法来制备。
6.根据权利要求1-5中任何一项所述的方法，其中，所述方法使用功能化的树脂，所述功能化的树脂选自由聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚二甲基丙烯酰胺、聚乙二醇、纤维素、聚乙烯、聚乙二醇接枝的聚苯乙烯、胶乳和戴诺免疫磁珠组成的组。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，通过酸将本发明的肽从固体支持材料上切除。
8.根据权利要求5或6所述的方法，其中，通过碱将本发明的肽从固体支持材料上切除。
9.根据权利要求1-4中任何一项所述的方法，其中，所述肽通过溶液合成法、Merrifield型固相合成法或重组DNA技术来制备。
10.根据权利要求1-4中任何一项所述的方法，其中，所述肽通过重组DNA技术来制备，其包括如下步骤: (a)在允许所述肽生产的条件下，培养含有编码所述肽的核酸序列的重组宿主细胞，和 (b)从所述培养物中分离所述肽。
11.根据权利要求1-4中任何一项所述的方法，其中，所述肽通过重组DNA技术来制备，其包括如下步骤: Ca)将编码所述肽的核酸序列转入到宿主细胞中，(b)培养所述宿主细胞，和(c)从所述培养物中分离所述肽。`
【文档编号】C07K1/04GK103497237SQ201310198558
【公开日】2014年1月8日 申请日期:2005年8月26日 优先权日:2005年8月26日
【发明者】托马斯·恩格尔布雷希特·诺克尔德·约纳森, 瑟伦·尼尔森, 约尔延·弗洛基尔, 比亚内迪尤·拉尔森 申请人:艾伯维有限公司